[发明专利]一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法有效
| 申请号： | 201610055659.6 | 申请日： | 2016-01-28 |
| 公开（公告）号： | CN105624295B | 公开（公告）日： | 2020-02-07 |
| 发明（设计）人： | 甄毓;乔玲;米铁柱 | 申请（专利权）人： | 中国海洋大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6851 | 分类号： | C12Q1/6851;C12R1/89 |
| 代理公司： | 37104 青岛高晓专利事务所(普通合伙) | 代理人： | 张晓波 |
| 地址： | 266100 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其中，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，其特征在于，进一步包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞‑质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量。本发明利用多形微眼藻的特异性引物通过荧光定量PCR技术对海水中的多形微眼藻进行检测，在确保准确性的基础上，不仅提高了灵敏度，而且实现了样品在短时间内进行大批次处理的目的，大大缩短了工作时间，为实现对多形微眼藻进行快速、准确的定性定量研究提供了强大的工具。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 多形微眼藻 荧光 定量 pcr 检测 方法 | ||
【主权项】：
1.一种多形微眼藻荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括A、藻种培养及收集，B、藻类总DNA的提取，C、核糖体18S rDNA的PCR扩增，D、电泳检测及测序，以及包括如下步骤：E、多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物的设计和验证，F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备，G、多形微眼藻细胞-质粒标准曲线的建立，H、环境样品中多形微眼藻的定量，/n步骤E中多形微眼藻荧光定量PCR特异性引物为：/nMpF：5’-TTAGATAGAAACCAACCCTC/nMpR：5’-ATACCCTACCATCCAAAG/n步骤F、多形微眼藻18S rDNA质粒标准品制备：以多形微眼藻DNA为模板，以MpF和MpR为引物进行PCR扩增，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，电泳条件为110 V、35min，收集目的片段处的凝胶，回收目标DNA片段，然后进行连接、转化和培养，通过蓝白斑筛选得到目的基因的阳性克隆，将阳性克隆接种到LB液体培养基中，放到37℃摇床中过夜培养，取部分菌液送测序公司测序，用质粒提取纯化试剂盒提取阳性克隆质粒，制作多形微眼藻18S rDNA质粒标准品；/n所述核糖体的18S rDNA 基因序列：/nCAGATTTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAATACTTTTACTTTGAAACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTTATAGTTTATTTGATAGTCCCTTACTACTTGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCATCAATACCCAACTGTTCGCGGACGGGTAGTATTTATTAGATAGAAACCAACCCTCTTCGGAGGCGCTCAGGTGATTCATGATAACTCTGCGAATCGCATGGCCTCGTGCCGGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGCCCTATCAGCTTTGGATGGTAGGGTATTGGCCTACCATGGCTTTAACGGGTAACGGATAATTAGGGTTAGATTCCGGAGAGGGGGCATGAGAGATGGCCACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACACAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTCTAGGTCTGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCAATTGGAGGGCAAGCCTGGTAAGA 。/n
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