[发明专利]稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备

摘要

本发明公开了一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法，通过构建一种融合表达近红外荧光iRFP682蛋白和CD63蛋白的质粒载体，然后用此质粒包装的重组腺相关病毒(rAAV)和辅助病毒以一定比例共感染人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞，筛选获得能稳定表达近红外荧光蛋白iRFP682标记的外泌体的人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞，然后采用分步离心法分离提纯近红外荧光蛋白iRFP682标记的外泌体进行鉴定。本发明最终得到一个可用于乳腺癌肿瘤微环境体内体外研究的新型生物标志物，为进一步研究细胞间物质转移机制提供了有力工具，同时也给癌症的诊断和治疗方案提供新的支持和契机。

主权项

一种稳定分泌近红外荧光标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1)编码外泌体标记蛋白CD63基因的获得：从人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞中提取总RNA进行逆转录得到cDNA，用带XbaI和ClaI酶切位点，以及Linker序列的引物进行PCR扩增得到目的基因片段CD63‑Linker；2)重组质粒载体的构建：步骤1)得到的所述CD63‑Linker和质粒骨架pAAV‑iRFP682经T4DNA连接酶作用得到重组质粒载体pAAV‑CD63‑Linker‑iRFP682；3)重组腺相关病毒的制备：使用所述重组质粒载体pAAV‑CD63‑Linker‑iRFP682和辅助质粒体外共转染AAV‑293细胞，包装重组腺相关病毒rAAV‑CD63‑Linker‑iRFP682；4)稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的乳腺癌细胞株的制备：使用所述重组腺相关病毒rAAV‑CD63‑Linker‑iRFP682和辅助腺相关病毒共感染人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞，通过荧光筛选获得稳定分泌近红外荧光蛋白标记外泌体的人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞株；5)近红外荧光标记人乳腺癌MDA‑MB‑231细胞的外泌体提取及鉴定：采用分步离心法从步骤4)标记成功的MDA‑MB‑231细胞培养上清液中提取iRFP682标记的外泌体并进行鉴定。