[发明专利]一种用于早期筛检大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物、试剂盒及其应用

摘要

本发明公开了一种用于早期筛检大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物、试剂盒及其应用，属于疾病的早期筛检与防治领域。所述引物通过MS‑HRM方法检测IGF2基因启动子区CpG岛的甲基化表型，其中正向引物具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，反向引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。研究表明，采用该引物对待测硫化后的DNA进行MS‑HRM分析，可以判断待检样品是否为人大肠癌高危人群。进一步的，本发明还提出了包含上述引物的试剂盒。采用本发明的引物或试剂盒筛检大肠癌，具有高通量、灵敏度高和特异性好等特点，能够在人外周血白细胞DNA水平上实现便捷快速地筛检大肠癌高危人群。

主权项

1.一种用于早期筛检大肠癌相关IGF2基因甲基化表型的引物，其特征在于所述引物由正向引物和反向引物组成，其中正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述的引物用于筛检大肠癌相关IGF2基因甲基化表型时，包括以下步骤：（1）将待检的人外周血白细胞DNA进行硫化修饰处理，取硫化后 DNA，作为RT‑PCR的反应模板进行MS‑HRM检测，所述的硫化后 DNA的量至少为20ng/反应；（2）在总体积为10微升的RT‑PCR反应体系中，加入1～2微升的待测硫化后DNA作为模板，加入正向引物和反向引物，正向引物和反向引物在 RT‑PCR反应体系中的终浓度均为 0.4μM；其他试剂按照常规方法及剂量加入；（3）进行RT‑PCR反应，反应条件为：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒，56℃复性30秒，72℃延伸20秒，采集荧光信号，循环45次；（4）进行MS‑HRM检测，检测条件为：95℃预变性1分钟；40℃复性1分钟，从60℃按照0.1℃/秒的梯度进行梯度升温至98℃，并采集荧光信号，40℃复性10分钟；（5）对MS‑HRM结果进行Tm‑Calling和Gene‑Scanning分析：如果待测样品与阳性标准品的Tm值相符，且待测样品的甲基化水平大于0.5%，即Cut‑Off值取为0.005，结果为阳性；反之，结果为阴性。