[发明专利]一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法

摘要

一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，属于生物技术领域。其包括以下步骤：1）收集冬孢子；2）冬孢子悬液；3）冬孢子培养；4）单孢分离培养；5）显微观察；6）性亲和菌株筛选；7）PCR鉴定。通过以上方法可快速稳定地筛选得到菰黑粉菌单倍体菌株，同时通过融合实验初筛及PCR验证交配型基因可准确地获得配对的性亲和单倍体菌株。

主权项

一种快速稳定分离鉴定菰黑粉菌性亲和单倍体菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：1）收集冬孢子：从龙茭2号灰茭直接挑取冬孢子；从龙茭2号正常茭挑取冬孢子；2）冬孢子悬液：将挑取的冬孢子堆置于5 mL无菌水中，经过滤，获得较纯的冬孢子悬液，再用无菌水将冬孢子悬液稀释成终浓度为10³个孢子/mL；3）冬孢子培养：取100 µL冬孢子悬液涂布于担孢子分离培养基上，28℃培养60 h，以肉眼可见细小分散的单菌落为标准；4）单孢分离培养：挑取单个肉眼可见的菌落至清水中，稀释成10³个孢子/mL，每次取1 µL置于显微操作仪下用毛细吸管吸取单个担孢子，将分离出的担孢子在YEPS固体培养基上，28℃培养4 d；5）显微观察：对担孢子形成的菌落形态用光学显微镜进行显微观察，若菌落边缘光滑则可初步鉴定为单倍体菌株，若边缘产生了菌丝，则舍弃；6）性亲和菌株筛选：将初步鉴定的单倍体菌株编号，并用YEPS液体培养基分别稀释成浓度为OD₆₀₀为1.5‑2.0的菌液，通过融合反应实验对性亲和菌株进行初步鉴定，培养后若可见白色气生菌丝，则混合培养的两个菌株可能为性亲和单倍体菌株；7）PCR鉴定：设计特异性引物用于进一步对筛选得到的两个性亲和单倍体进行PCR验证，如性亲和单倍体菌株能通过不同的特异性引物扩增出长度在600 bp左右的片段，则确定为两个性亲和单倍体菌株，所述的特异性引物为引物pra1‑F、引物pra1‑R、引物pra2‑F、引物pra2‑R、引物pra3‑F和引物pra3‑R，所述的引物pra1‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，引物pra1‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，引物pra2‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，引物pra2‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，引物pra3‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，引物pra3‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。