[发明专利]一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法

摘要

本发明公开了一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒及制备方法，包括：肌钙蛋白抗体‑大颗粒荧光颗粒结合物配制；硝酸纤维素膜标记抗体的制备；试剂卡的装配；TNI校准品配制；建立标准曲线；计算出待测样本中肌钙蛋白的含量；所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒包括：硝酸纤维素膜、试剂和校准品。本发明试剂盒的最低检测限可达0.1 ng/ml，满足了临床应用的需求；从样本采集到出具检测结果最快只需10‑15分钟，为患者争取了更多的宝贵时间，可对患者病情进行动态检测。本发明结果相关性好，无显著差异，检测结果准确可靠，在临床上可以替代进口产品使用，大幅降低了检测成本。

主权项

一种定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法，其特征在于，所述定量检测肌钙蛋白I含量免疫荧光试剂盒的制备方法包括以下步骤：第一步，肌钙蛋白抗体‑大颗粒荧光颗粒结合物配制，使用磷酸缓冲液浓度为10mM，缓冲液包括磷酸二氢钠0.39克，磷酸氢二钠1.02克，唑氮钠0.2克；用盐酸调节pH为7.2，再加入BSA5克，使终浓度为：BSA5mg/ml、Proclin0.05％w/v；第二步，硝酸纤维素膜标记抗体的制备，取CN140硝酸纤维素膜30cm，置放于点膜仪上，按照点膜仪操作要求，将抗体液体以1ml/cm的速度均匀点在膜上；第三步，试剂卡的装配，将标记有抗体的硝酸纤维素膜置于合适卡盒底盒中指定的位置，在依次放入样品垫，吸水垫，然后盖上卡盒上盒，并置于湿度不高于20％的密封合内保存；第四步，TNI校准品配制，将人肌钙蛋白重组蛋白溶于磷酸缓冲液加5％牛血清中，制成不同浓度的校准品；以肌钙蛋白校准品为原始标准，采用肌钙蛋白试剂盒对不同浓度的校准品分别检测20次，求出均值，得到肌钙蛋白校准品的浓度：0.2，0.67，1,3,4.8，10，27.3ng/ml；第五步，建立标准曲线；将上述7个标准品溶入含有5％的牛血清的磷酸缓冲液，然后每种取75ul，滴入测试卡的样品孔中，等待10分钟，有检测仪读取荧光信号，然后带入Excel软件进行计算，得到标准曲线；第六步，由免疫荧光检测仪收集发射光波长的数据，代入校准曲线y＝0.9188x+0.5444，由此计算出待测样本中肌钙蛋白的含量；所述肌钙蛋白抗体‑大颗粒荧光颗粒结合物配制具体包括：步骤一，胶乳粒子的活化、洗涤，取2％醛基基化乳胶胶乳颗粒溶液100μ1，向胶乳溶液中加入0.6mg/mlNaBH4溶液I.1ml，置于37℃往复式摇床中反应2h；12000rpm离心30min，弃上清，加入50mMpH7.2磷酸缓冲液洗涤三次，将沉淀分散于10mMpH7.2磷酸缓冲液中，使胶乳颗粒浓度为1％w/v；步骤二，大尺寸乳胶颗粒化肌钙蛋白抗体的交联，用10mM磷酸缓冲液将5mg/ml羊抗人TNI多克隆抗体稀释成1mg/ml的抗体溶液，在1ml制备的活化胶乳颗粒溶液中加入400μl抗体溶液，置37℃摇床lh，形成大尺寸乳胶颗粒‑TNI多克隆抗体连接复合物，12500rpm速度离心20min，弃上清，将沉淀物溶于O.1MpH7.4PBS缓冲液，混匀，12500rpm离心20min，弃上清，而后重复洗涤两次；将末次沉淀溶解于含4mg/mlBSA及0.05％的Proclin300的10mM磷酸缓冲液；所述胶乳颗粒的制备方法包括以下步骤：步骤一，大颗粒胶乳粒子的活化、洗涤；将大颗粒表面修饰的氨基基团活化，将乳胶胶乳溶液活化后离心，弃上清，沉淀用洗涤缓冲液重复洗涤3次；将末次沉淀重悬于所述洗涤缓冲液中，使胶乳颗粒的质量体积比终浓度为1％，所述洗涤缓冲液选自PBS缓冲液和MES缓冲液中的一种；步骤二，肌钙蛋白I抗体包被胶乳颗粒取Iml活化洗涤后的胶乳溶液，加入肌钙蛋白I抗体，使肌钙蛋白I抗体终浓度为1mg/ml；混匀后，置37℃摇床，以220rpm转速包被18h；用PBS缓冲液洗涤未与胶乳粒子结合的肌钙蛋白I抗体，重复3次；封闭：将洗涤后的包被肌钙蛋白I抗体的胶乳颗粒溶于包含保护剂的缓冲液中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.1‑0.14％；步骤三，抗人肌钙蛋白抗体和大尺寸乳胶颗粒结合后的封闭，将大尺寸乳胶颗粒与所述抗人肌钙蛋白抗体混合物，加入脱脂奶粉0.3％，室温下反应2h，离心，除去其中少量的沉淀物；步骤四，清洗，将步骤三中形成的大尺寸乳胶颗粒‑抗人肌钙蛋白抗体复合物溶液离心，弃上清，加入磷酸盐缓冲液重复清洗3次；将末次沉淀溶于含所述保护剂和防腐剂的缓冲液中，使所述胶乳颗粒的质量体积比终浓度为0.04％‑0.14％。