[发明专利]以愈伤组织诱导白及四倍体的方法

摘要

本发明公开了以愈伤组织诱导白及四倍体的方法，利用化学诱导剂0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO对愈伤组织进行短时间诱导处理，再进行增殖、分化和生根培养，经实验统计白及四倍体诱导率为2.6%～23.4%。采用本发明方法既可以提高四倍体的诱导率，又能减少化学诱导剂对细胞毒害作用。根据细胞全能性原理，再分化过程中，一个细胞分化为一个植株，可有效减少杂合体的发生。因此，该方法具有操作简单、易控制、重复性好、诱导率高、多倍体的纯化率好等优点。

主权项

以愈伤组织诱导白及四倍体的方法，其特征是包括以下步骤：（1）在超净工作台上，将白及愈伤组织切分成0.3cm×0.3cm的小块，接入增殖培养基中培养10 d；在无菌条件下，往培养瓶中加入灭菌过的化学诱导剂，化学诱导剂浸泡愈伤组织8～24 h；所述的化学诱导剂为：0.05～0.2%秋水仙素+3%DMSO；所述增殖培养基为：N6+2,4‑D 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+TDZ 0.5 mg/L，pH6.0；（2）在超净工作台上，将步骤（1）中的愈伤组织取出，放入无菌水中清洗，用无菌滤纸吸干水，接入分化培养基中培养，22～30 d产生芽点，36～43 d形成芽，55～65 d芽长出2～3片叶，芽粗壮，叶色深绿色；所述分化培养基为：MS+6‑BA 1.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+NAA0.5 mg/L，pH6.0；（3）在超净工作台上，将步骤（2）中得到的芽接入生根培养基中培养，7 d时芽的下端出现突起，12～16 d开始长根，45～50 d根长为1.0 cm；所述生根培养基为：1/2MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 1.0 mg/L+KT 0.4 mg/L，pH6.0；（4）上午9～11点，在超净工作台上，将步骤（3）中得到的白及小苗取出，放在灭菌过的盘子里，切下0.5‑1.0 cm长的根尖，将根尖立即放入预处理液中，处理3 h，将小苗上剩余的根系切除，再接入生根培养基中培养，并将根尖与小苗编号；所述的预处理液为：0.1%秋水仙素溶液；（5）将步骤（4）中的预处理液中的根尖取出，用蒸馏水清洗后以卡诺氏固定液固定3 h，将固定好的根尖用蒸馏水清洗，放入盛有1N盐酸的小烧杯中，在55‑65℃的水浴锅中处理15～20 min，水浴完毕后蒸馏水清洗，切除根冠，留下根尖分生区，以改良品红染色20 min，将染色后的根尖分生区置于干净载玻片上，加入一滴蒸馏水，将根尖弄碎，盖上玻片后再加盖一张吸水纸用大拇指轻压，最后敲击直到根尖分散成雾状；（6）将步骤（5）中做好的载玻片的根尖在显微镜下镜检，将染色体数量为64条的小苗的编号和数量记录下来；统计白及四倍体诱导率为2.6%～23.4%。