[发明专利]一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法

摘要

本发明公开了一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，本方法将同一患者不同部位的组织样本固化在同一张组织芯片上，然后可对这张组织芯片进行免疫组化、免疫荧光、荧光原位杂交等多种检测。有效地降低实验成本，节省时间、人力，也可减少由于分次实验造成的误差，提高实验结果的一致性，实现较好的质量控制。本方法采用多探针联合荧光原位杂交技术评估三阴性乳腺癌瘤内异质性，降低了对昂贵设备的依赖性和投资成本，易于大范围推广。本发明对三阴性乳腺癌瘤内异质性进行定量检测，为准确预测患者术后复发和转移风险提供明确的评估指标。

主权项

一种用于检测三阴性乳腺癌瘤内异质性的方法，其特征是：包括以下步骤：步骤一、三阴性乳腺癌瘤内异质性检测芯片的制作：1)制作受体蜡块：在石蜡包埋机下，用模具制备受体蜡块；采用组织取样针在受体蜡块上打孔，相邻孔芯之间具有一定间隙，使孔芯在受体蜡块上形成微阵列；2)供体蜡块取材：收集数组所需检测的三阴性乳腺癌组织及配对正常组织石蜡标本作为供体蜡块；每组供体蜡块制切片后均进行H&E染色，观察组织结构典型的乳腺癌区，并在玻片上圈出，对照H&E染色切片，在供体蜡块相应部位上作出标记；在组织芯片制作仪上用同一直径的取样针对供体蜡块标记部位进行取样，一组取数个不同位置的癌组织和一个正常对照组织的组织芯；瘤内异质性组织芯片制作：将每组供体蜡块上取得的组织芯按一定排布规律，垂直塞入受体蜡块对应位置的空白孔芯中；将做好的组织芯片放回蜡块模中，加热至半熔后，将组织芯片冷却，再加热至半熔，重复数次，使组织芯与受体蜡块紧密结合；然后将组织芯片表面修平；将组织芯片切片并进行H&E染色，再次确认取材点是否与供体蜡块标记的目标区域相同；步骤二、多探针联合荧光原位杂交：探针选择：采用两个双色探针和一个单色探针进行三阴性乳腺癌瘤内异质性的检测；每个探针单独进行荧光原位杂交，步骤相同，具体如下：切片预处理：将制作好的组织芯片切片，将切好的白片保温，过夜；次日室温二甲苯中脱蜡，再对切片浸洗处理，自然晾干玻片；b、变性杂交：避光下滴加探针覆盖切片目标区域，加盖盖玻片并用树脂胶封边，放入杂交仪过夜；c、洗涤复染：避光下取出玻片，揭去封胶，室温浸于SSC液中使盖玻片自然脱落，对玻片浸洗处理，自然晾干玻片，滴加DAPI封片，放置15min后于荧光显微镜下观察并拍照；步骤三、计算瘤内异质性1)每个点计数多个轮廓清晰、与周围细胞没有重叠、荧光信号清晰的细胞，记录下每个细胞内部红色信号和绿色信号的个数，每个细胞可计算其拷贝比值；2)将每组细胞的信息进行汇总，计算每组的瘤内异质性指数，具体公式为：H’ = ‑∑ pi ln(pi) ,其中pi代表第i个拷贝值的细胞在所有细胞中所占的比例；每组将三个探针的H’求和得出总的瘤内异质性指数H。