[发明专利]一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法

摘要

本发明公开了一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法，属于固定化酶制备技术领域。本发明利用产漆菌种发酵制得漆酶酶液，掺加磁性粒子，辅以海藻酸钠对其固定，振荡吸附后干燥，从而得到磁性海藻酸钠固定化漆酶的制备方法。该方法工艺简单，成本低廉，制得的磁性海藻酸钠固定化漆酶不仅活力在250IU/mL以上，总产量也提高至85～90％，均达到了较高水平，而且纳米级磁性粒子的掺入使其更容易进行吸附，易于分离，使得固定化漆酶回收率提高，稳定性也得到显著增强，具有优异的性能。

主权项

一种磁性海藻酸钠固化漆酶的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：（1）按接种量为培养基底物质量5～7%将白毒鹅膏菌接种到装有50～100mL基础液体培养基的300mL三角瓶中，放置在摇床上在25～30℃下以100～200rpm的速率恒温振荡培养3～5天，用无菌水淋洗菌丝表面并收集淋洗液，得到菌丝悬浮液，于4～6℃下保存；（2）向80～100mL基础液体培养基中分别加入1～2%（w/v）茶叶、1～2%（w/v）豆粕和1～2%（w/v）蔗渣组成的混合物以及5～10mL浓度为0.5mol/L硫酸铜溶液，混合均匀后再加入20～25mL上述制备的菌丝悬浮液，放入恒温箱在25～35℃下发酵7～8天，再将发酵液移入卧式离心机，以7000～9000r/min转速离心分离，得上清液即为漆酶酶液，备用；（3）按摩尔比为3:2将浓度为0.3mol/L氯化铁和0.2mol/L氯化亚铁溶液混合均匀，取100～200mL混合液装入300mL三口烧瓶中，用质量浓度为17%氨水调节pH至9～10后，向烧瓶中以10mL/min速率持续通入氮气并移入水浴锅中，升温至75～85℃保温熟化30～40min，在磁场作用下吸附分离，得纳米级磁性粒子；（4）取1～3g纳米级磁性粒子在超声作用下分散于40～50mL浓度为10%海藻酸钠溶液中，制得混合液，用注射器向制得的混合液中注入200～300mL蓖麻油并移入高剪切乳化机，以12000～13000r/min转速进行乳化，在乳化过程中再逐滴滴入5～10mL蔗糖脂肪酸酯，滴加完毕后继续乳化5～10min；（5）乳化结束后将乳化液倒入400～500mL质量浓度为5%氯化钙溶液中，用搅拌棒搅拌均匀后静置沉淀过夜，再过滤分离得到沉淀物，将得到的沉淀物用含有5%脂肪酸甘油酯水溶液冲洗1～2h，放入烘箱在105～110℃下干燥至恒重；（6）称取20～30g上述冲洗干燥后的烘干物放入装有300～500mL步骤（2）制备的漆酶酶液的漩涡振荡仪中，以30～50W功率在30～40℃下振荡吸附12～24h后滤出，真空干燥后即得一种磁性海藻酸钠固化漆酶。