[发明专利]一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用

摘要

本发明公开了一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统及其应用，所述测试系统包括：(1)用于表达sgRNA的质粒；(2)用于表达Cas9的质粒；(3)用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的C‑端与报告基因的N‑端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点；在利用CRISPR/Cas9系统编辑(敲除)特定基因之前，靶序列的选择至关重要，这个选择会影响sgRNA对目的DNA的识别效率、与目的DNA的结合效率、Cas9的靶向切割效率和NHEJ修复效率，利用本系统可定量比较不同sgRNA–靶DNA序列的基因编辑效率，可以在短时间内确定工作效果最佳的sgRNA，提高实际敲除的成功率，这不仅可以降低工作成本，还可以提高工作效率，推动工作进程。

主权项

1.一种CRISPR/Cas9工作效率快速测试系统，其特征在于所述测试系统包括：（1）用于表达sgRNA的质粒；（2）用于表达Cas9的质粒；（3）用于测试CRISPR/Cas9基因编辑效率的报告系统；所述报告系统是将能够编码有效蛋白的核苷酸片段的3'‑端与报告基因的5'‑端拼接，拼接处插入两个限制性核酸内切酶酶切位点，以便插入sgRNA靶向的目标DNA序列；插入目标序列后后随的报告基因因为移码而在细胞中无活性，但当sgRNA引导的CRISPR核酸酶在目标序列对应位点产生DNA双链断裂时，理论上NHEJ修复会有大约三分之一的机会恢复报告基因的正确编码而产生活性，从而可以根据报告基因活性水平快速测试sgRNA介导的在目标靶点的CRISPR工作效率。