[发明专利]一种四价流脑-Hib联合疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种四价流脑-Hib联合疫苗的制备方法，包括发酵培养、将培养液进行灭菌沉淀、并经过解离和去核酸处理；最后经过除去蛋白杂质，活化和偶联，并与吸附剂氢氧化铝吸附后制得联合疫苗。本发明以脑膜炎球菌和B型流感嗜血杆菌的荚膜多糖为目标抗原，通过化学偶联的方法，将其与载体蛋白质破伤风类毒素相连接，经过纯化、吸附后，分装制备而成；可以满足一针疫苗同时预防A群、C群、Y群和W135群流脑细菌，以及B型流感嗜血杆菌引发的传染病。

主权项

一种四价流脑‑Hib联合疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)发酵培养：将A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种、W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌种和B型流感嗜血杆菌分别接种到发酵罐中发酵，并于对数生长的后期或静止期的前期终止培养，获得培养液；(2)灭菌沉淀：将培养液灭菌后高速离心，收集上清液，并在上清液中加入十六烷基三甲基溴化铵充分混匀，然后静置再离心，收集沉淀物；(3)解离：在脑膜炎球菌的沉淀物中加入氯化钙溶液研磨均匀，并将混合液搅拌解离十六烷基三甲基溴化铵；在B型流感嗜血杆菌沉淀物中加入氯化钠溶液中解离，解离后离心收集上清液；分别得到脑膜炎球菌多糖复合物和B型流感多糖复合物；(4)去核酸：脑膜炎球菌多糖复合物中加入2℃～8℃的95％乙醇溶液混匀，静置后离心去沉淀，收集上清液，得到脑膜炎去核酸多糖复合物；B型流感嗜血杆菌多糖复合物微孔过滤后进行超滤浓缩，并使用PBS溶液反复清洗浓缩液，收集浓缩洗涤液，并加入乙醇溶液在低温条件下静置；再离心去除沉淀；上清液再加入无水乙醇静置，并再次离心分别收集沉淀和上清液，沉淀用水溶解后离心去除不溶物；上清液使用23～25KD的透析袋透析，得到B型流感去核酸多糖复合物；(5)除杂：将脑膜炎去核酸多糖复合物溶解于乙酸钠溶液中，使用截留量为6000道尔顿的超滤膜进行超滤，收集超滤液，并浓缩干燥得到脑膜炎多糖；将B型流感去核酸多糖复合物溶于醋酸钠溶液中并使用冷酚法抽提数次，搅拌离心后收集上清液并通过透析或者超滤脱酚，再加入乙醇溶液至终浓度60％～80％，并离心收集沉淀物，并使用无水乙醇和丙酮离心洗涤，真空干燥后得到B型流感多糖；(6)活化：将脑膜炎多糖和B型流感多糖分别溶于无菌蒸馏水调节pH值至碱性，在20℃～30℃下活化，然后加入酸液调节pH值至弱碱性，加入己二酸二酰肼ADH反应，反应完毕后调节pH值至近中性反应10min～30min，然后降温至2℃～8℃搅拌12h以上，最后在酸性环境下透析、微孔过滤、真空冻干；得到活化多糖；(7)偶联：将活化多糖与破伤风类毒素蛋白混合，调节pH值至5.5～5.9，加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺EDC于2℃～8℃反应，反应完毕后调节pH值至6.7～7.1透析，透析液经过柱层析纯化、浓缩后使用超滤膜除菌，得到结合物原液；(8)将结合物原液与氢氧化铝吸附，得到四价流脑‑Hib联合疫苗。