[发明专利]一种测定运动小鼠胰腺组织样品中胰蛋白酶的方法

摘要

本发明属于电化学技术领域，以肽为识别单元和亚甲基蓝为信号分子对胰蛋白酶含量进行检测。利用利用戊二醛法，通过肽末端氨基与DNA氨基作用，将肽和DNA交联，得肽/DNA；然后利用Au原子与肽末端巯基之间作用，将肽/DNA修饰在金电极表面；再加入H1和H2，发生杂交链式反应形成DNA双链，然后加入亚甲基蓝，亚甲基蓝扦插在形成的DNA双链中；当有目标物胰蛋白酶存在时，胰蛋白酶将肽切割导致扦插有亚甲基蓝的DNA双链从电极上脱落，电化学信号降低，根据电化学信号的强弱实现目标物胰蛋白酶的测定，建立了一种对运动小鼠胰腺组织样品中胰蛋白酶高灵敏度特异性检测的电化学方法，方法具有简单，成本低，灵敏度高的特点。

主权项

1.一种测定运动小鼠胰腺组织样品中胰蛋白酶的方法，包括以下步骤：(1)取0.1～20μg肽固体分散在含5％戊二醛的PBS缓冲溶液中，持续搅拌2h后再向溶液中加入100μL浓度为0.1～1000m M的DNA1溶液，4℃振动孵育12h后，得肽修饰DNA1，即肽/DNA1，4℃下保存；(2)首先将金电极分别用1.0μm，0.3μm，0.05μm氧化铝粉抛光，依次用蒸馏水，乙醇和蒸馏水分别超声5min，最后在0.1M的H₂SO₄溶液中进行循环伏安扫描直至电流电压曲线稳定；在洁净的金电极表面滴加(1)所得的1～60μL肽/DNA1溶液，在25℃下组装120min；修饰了肽/DNA1的金电极表面用去离子水洗净三次，用高纯氮气吹干；然后将金电极浸入1mM的巯基己醇溶液中，25℃下封闭60min，充分洗净后得肽/DNA1修饰金电极，4℃下保存备用；(3)取1～60μL含0.001～400μM的H1和H2的混合溶液滴于(2)所得的肽/DNA1修饰金电极表面；在室温下反应一段时间后，再用50μL的PBST溶液洗涤三遍；然后再取1～60μL含0.001～400mM的亚甲基蓝溶液滴于电极表面，在室温下反应30分钟后，再用50μL的PBST溶液洗涤三遍；得H1、H2和亚甲基蓝自组装肽/DNA修饰金电极；(4)将1～60μL胰蛋白酶样品溶液滴加到H1、H2和亚甲基蓝自组装肽/DNA修饰金电极表面，在室温下反应30min；然后，用磷酸缓冲溶液反复冲洗电极表面三次；以上述所得电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，利用差分脉冲伏安法DPV在磷酸缓冲溶液中以1～1000mV/s的扫速进行扫描，电位扫描范围为‑0.4到‑0.1V；根据电化学信号对胰蛋白酶进行定量；(5)小鼠运动方式采用一次性力竭性游泳，水温控制在32±1℃，小鼠游泳池规格为长100cm×50cm×50cm，小鼠持续下沉十秒不能露出水面为力竭标准；小鼠断头取材，按1:10加入匀浆介质后，将其制成组织匀浆，在3000转/分钟的条件下冷冻离心15min，取上清液按(4)所述方法测定胰蛋白酶；其中所述的肽的序列和DNA的序列如下：所述的肽的序列为GGRGGC；所述的DNA1的序列为5′‑TGA GGT AGT AGG TTG TAT AGT T‑3′；所述的H1的序列为5′‑AGG GCG GGT GGG TTG TAT AGT AGG CAA AGT AAC TAT ACA ACC TAC TAC CTC ATG GGT‑3′；所述的H2的序列为5′‑TGG GTA CTT TGC CTA CTA TAC AA T GAG GTA GTA GGT TGT ATA GTA GGG TAG GGC GGG‑3′。