[发明专利]梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法

摘要

梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，涉及梅毒特异性IgM抗体的检测。制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜；制备抗人γ链单克隆抗体；抗人μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；硝酸纤维素膜洗涤；加入辣根过氧化物标记的抗人μ链单克隆抗体孵育；磷酸盐缓冲液洗涤，显色；加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；结果判读：硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。重组抗原包被的硝酸纤维素膜延长已包被抗原的保存时间，可实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性；应用斑点酶联免疫吸附法检测梅毒特异性IgM抗体不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强。

主权项

梅毒螺旋体IgM抗体Dot‑ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔，作为点样部位；用微量取液器取0.5μL抗原混合物，加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭；将封闭后之硝酸纤维素膜置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴晾干燥处备用；3)以人μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人μ链单克隆抗体；4)采用过碘酸钠法进行抗人μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；5)将步骤2)得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品50μL，37℃孵育10min；6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人μ链单克隆抗体，37℃孵育10min；8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；9)加入显色剂，37℃放置5min后，再加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；10)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。