[发明专利]一种基因组混样测序文库的制备方法

摘要

本发明涉及分子生物学技术领域，公开了一种基因组混样测序文库的制备方法，包含下述步骤：(1)基因组DNA超声波打断；(2)打断产物进行纯化和末端修复；(3)修复产物进行纯化和接头连接；(4)连接产物纯化回收和浓度测定；(5)混样和片段筛选；(6)片段筛选后的产物进行PCR扩增；(7)纯化PCR产物，得到测序文库；(8)文库质检和上机测序。本发明提供了上述步骤(2)中兼容于Illumina二代测序仪的接头、步骤(2)(3)(4)(7)中对产物进行纯化的方法、步骤(4)中混样的方法以及步骤(6)中PCR扩增体系及程序设置，保证了本发明所提供的建库方法能够快速顺利的进行多个样本混样建库，利用本发明所提供的方法可得到数据均一度好和质量较高的测序数据。

主权项

一种基因组混样测序文库的制备方法，包括以下步骤：(1)对需要混样测序样品的基因组DNA进行超声打断，打断的插入片段为350bp；(2)对超声打断的片段进行纯化，利用NEB末端修复试剂对纯化产物进行末端修复；(3)对末端修复产物进行纯化，利用特异的含不同标签(Barcode)接头序列分别对纯化产物进行连接反应，连接试剂采用NEB快速连接试剂；接头的序列如下：P5‑P7‑F(5’‑3’)：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNN*TP5‑P7‑R(5’‑3’)：/5Phos/YYYYYAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC其中，设计的P5‑P7‑R引物中的五碱基序列YYYYY与P5‑P7‑F引物中的五碱基序列NNNNN反向互补，其中NNNNN代表标签(Barcode)序列(表1)，主要用于标记混样各个样本；(4)对上述连接产物进行纯化，对后续需要混样的纯化产物逐一进行浓度测定；(5)参照上述纯化产物的浓度和总量，依据所测样本的测序量对纯化产物进行混合，混合后进行片段筛选，片段筛选采用琼脂糖电泳和切胶回收的方法；(6)利用含索引(Index)序列的PCR引物对上述的回收片段进行PCR扩增，PCR产物利用1.6倍体积的磁珠纯化两次，纯化后的产物即为测序文库；PCR引物序列为：F(5’‑3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC，R(5’‑3’):CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC，其中，PCR引物R序列中的NNNNNN代表索引(Index)序列，索引用于标记不同的混样文库，不同混样文库选用不同的索引(Index)引物；(7)纯化PCR产物进行纯化回收即可得到测序文库；(8)对上述测序文库进行浓度和片段大小范围检测；将文库浓度将检测合格后的文库利用Illumina公司的二代测序仪进行高通量测序。