[发明专利]一种扇贝足丝蛋白体外表达方法及应用

摘要

本发明涉及生物材料领域，公开了一种扇贝足丝弹性蛋白的发现、体外表达和性质研究，包括了关键组分蛋白的发现和体外重组表达等；通过对提取的扇贝足丝纤维蛋白组分进行分析，发现了一种扇贝足丝蛋白中的关键组分；利用基因克隆技术从扇贝基因组中获得了该基因重复序列部分的序列，建立了该基因重要重复序列片段的体外重组表达，获得了高效的体外重组表达。并对重组表达的组分进行了性质研究，结果提示该重复蛋白组分在溶液中具有形成β-折叠结构的特点，是一种良好的弹性蛋白材料，在医用材料等多个领域具有广阔的应用前景。

主权项

一种扇贝足丝蛋白体外表达方法，其特征在于，包括了蛋白的质谱鉴定，具体操作步骤如下：扇贝足丝蛋白的采集：将市售的栉孔扇贝培养在19℃恒温循环海水的条件下，每隔一天用干净手术刀片对黏附在培养笼中的足丝纤维蛋白进行刮取，进行足丝全蛋白的收集，收集到的足丝纤维置于‑20℃冰箱内保存；扇贝足丝蛋白的粗提取：将收集到的扇贝足丝蛋白干粉在液氮中研磨成粉末，分装到1.5mL EP管中，加入30μL 5％醋酸‑盐酸胍裂解液，37℃金属浴抽提足丝蛋白30分钟，然后于20,000g 4℃高速离心30分钟，取上清，作为扇贝足丝黏附蛋白粗提液；蛋白质质谱鉴定：将提取的蛋白质透析浓缩后按照每100μg蛋白质底物加入3.3μg酶的比例加入1μg/uL的Trypsin，37℃水浴24小时，利用Q‑Exactive质谱仪检测消化后得到的肽段溶液中的肽段信号，以实验室自己建立的栉孔扇贝足转录组数据库为模板，对质谱检测到的肽段序列进行搜索；体外表达：基于足转录组数据库对应的ORF，进行引物设计，利用PCR技术获得目的片段，构建其中针对第一段重复序列的体外重组表达系统，DNA测序验证体外重组表达系统构建成功，之后转化到大肠杆菌宿主菌中进行体外重组表达。