[发明专利]铜绿假单胞菌疫苗重组蛋白Vac14的纯化方法

摘要

本发明公开了一种铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白疫苗Vac14的纯化方法。Vac14蛋白为铜绿假单胞菌抗原分子的活性功能片段重组融合，通过大肠杆菌基因工程菌表达获得。采用对基因工程菌进行高压破菌、GST亲和层析、PP酶酶切、SP HP层析、G 25层析、Q HP层析等技术，获得高纯度的铜绿假单胞菌(PA)重组亚单位基因工程蛋白Vac14。该发明纯化工艺简捷、容易放大、重复性好，所获目标蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。

主权项

1. 一种铜绿假单胞菌亚单位重组基因工程疫苗候选抗原Vac14的纯化方法，该抗原的核酸序列如SEQ ID NO：1所示、氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其特征在于，包括步骤：收集制备的所述抗原Vac14、按照高压破菌、离心、GST亲和纯化、SP HP层析纯化、G 25层析纯化、Q HP层析纯化的顺序组合对制备的抗原进行纯化；其中，1）高压破菌将收集的Vac14菌体作为目标蛋白，用pH为7.0‑7.5的10mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；2）GST亲和纯化GST亲和层析填料进行初步纯化，使用A液对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶进行酶切洗脱：3）SP HP层析纯化经步骤2）收集的目标蛋白，用A液平衡层析系统及SP HP层析柱，B液线性梯度洗脱，其B液的组成为20mM Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄，1M NaCl ,pH7.0‑7.5；4）G 25层析纯化将经步骤3）纯化的目标蛋白，用G25层析柱纯化， C液平衡层析系统及层析柱，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液；5）Q HP层析纯化将经步骤4）纯化的标蛋白， C液平衡层析系统及Q HP层析柱，去除痕量非目标蛋白，内毒素等杂质，分离纯化目标蛋白；其中，A液为pH值7.0‑7.5的20mM Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄缓冲溶液，B液为pH7.0‑7.5的20mM Na₂HPO₄‑NaH₂PO₄，1M NaCl缓冲溶液，C液为pH6.0的10mM His，0.9%NaCl缓冲溶液。