[发明专利]一种六味五灵片的质量控制方法

摘要

本发明涉及复方中药制剂技术领域，具体涉及一种六味五灵片的质量控制方法；本发明采用拉丁超立方法将六味五灵片中6味药材随机抽样成20个不同比例组，建立相应的HPLC指纹图谱，并测定体外抗肝纤维化活性，利用SPSS软件进行分析，建立六味五灵片体外抗肝纤维化作用的谱效关系，本发明在六味五灵片药效物质基础上建立较完善的质量控制方法；本发明较以往单指标的含量测定方法更全面科学规范，多组分含量的同时测定，既缩短了分析时间，又节省了溶剂的耗损。

主权项

一种六味五灵片的质量控制方法，包括：步骤一：(1)仪器准备高效液相色谱仪；倒置生物显微镜；全波长酶标仪；水套CO2培养箱；电子分析天平；精密电子天平。(2)细胞准备LX‑2肝星状细胞，由北京协和细胞资源中心提供，培养于PRMI‑1640培养液，内含10％胎牛血清、L‑谷氨酰胺2nmol/L、青霉素100U/mL和链霉素100U/mL，37℃、5％ CO2常规培养。(3)药材与试剂五味子、女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、特女贞苷、连翘苷、连翘酯苷A、二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑盐(MTT)、色谱甲醇、乙腈、重蒸水。步骤二：(1)HPLC测定六味五灵片指纹图谱方法建立a.色谱条件色谱柱为ODS‑3柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈(A)‑0.1％磷酸(B)，梯度洗脱程序为0～5min，20％～22％ A，5～25min，22％～55％ A，25～38min，55％～75％ A，38～50min，75％～80％ A，50～60min，80％～85％ A；体积流量为1.0mL/min；检测波长为230nm，室温，进样体积为10μL。b.对照品溶液的制备分别精密称取五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、连翘苷、连翘酯苷A、特女贞苷对照品适量，加甲醇超声溶解，定容，摇匀，分别制成五味子醇甲(0.344g/L)、五味子酯甲(0.344g/L)、五味子甲素(0.276g/L)、五味子乙素(0.344g/L)、连翘苷(0.408g/L)、连翘酯苷A(0.312g/L)、特女贞苷(0.340g/L)对照品储备液。分别精密吸取上述各对照品贮备液适量，置50mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为混合对照品溶液，其中五味子醇甲13.76mg/L、五味子酯甲13.76mg/L、五味子甲素16.56mg/L、五味子乙素6.88mg/L、连翘苷16.32mg/L、连翘酯苷A 62.40mg/L、特女贞苷34.00mg/L，混合对照品图谱见图1。c.供试品溶液的制备对六味五灵片中各药材进行拉丁超立方采样，女贞子、连翘、莪术、苣荬菜、灵芝孢子粉均按0～1g，五味子按0～1.5g的药量进行抽样，得到20个不同比例的配伍组合，结果见表1。取上述20组药材分别混匀，置具塞锥形瓶中，加入10倍量80％乙醇，称定重量，回流提取2次，每次1h，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足失重，摇匀，滤过，合并滤液，精密吸取1mL合并液，挥干，供药效实验使用；另取2mL合并液，挥干，残渣加甲醇溶解，转移并定容至10mL量瓶中，用0.22μm微孔滤膜滤过，即得指纹图谱供试品溶液。表1 拉丁超立方随机抽样结果                                        单位：gd.精密度试验取1号供试液，连续进样6次，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明仪器精密度良好。e.稳定性试验取1号供试液，分别于0，2，4，8，12h进样，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明供试液稳定性良好。f.重复性试验取1号样品6份，按“步骤二：(1)c.”项下制成6份供试液，进样分析，测得各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％，表明重复性良好。g.指纹图谱测定精密吸取“步骤二：(1)c.”项下20份供试液各10μL，按“步骤二：(1)a.”项下色谱条件依次测定，记录20份供试液的色谱图。以峰面积较大、出峰时间居中的18号峰五味子酯甲为参照峰，以相对保留时间标定共有峰，采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件进行模式识别，获得六味五灵片20个不同比例组合提取物指纹图谱的共有模式，其指纹图谱匹配图见图2，生成的对照图谱见图3，共标定了23个特征共有峰。以对照图谱为参照，各样品指纹图谱与对照图谱进行比较，20个不同比例组合指纹图谱的相似度分别为0.987、0.985、0.935、0.983、0.936、0.994、0.805、0.995、0.992、0.987、0.933、0.931、0.983、0.947、0.977、0.768、0.984、0.989、0.986、0.981。参比各对照品溶液、各单味药材提取液、对照指纹图谱初步进行了共有峰的归属，五味子为1，14，17，18，19，20，21，22号峰，女贞子为4，23号峰，连翘为2，3，5，6，7，12号峰，莪术为8，11，13，15，16号峰，苣荬菜为10号峰，灵芝孢子粉为9号峰。其中2号峰为连翘酯苷A，4号峰为特女贞苷，7号峰为连翘苷，14号峰为五味子醇甲，18号峰为五味子酯甲，20号峰为五味子甲素，22号峰为五味子乙素。表3 六味五灵片不同组合提取物指纹图谱主成分分析h.六味五灵片不同组合提取物指纹图谱主成分分析本发明先将HPLC测得的各共有峰峰面积均数化，处理成量化特征峰数据，即X＝m峰的面积值/m峰平均面积值，结果见表2。再运用SPSS 19.0统计软件进行主成分分析，得到主成分方差及初始因子载荷矩阵，结果见表3、4。系统自动提取前4个特征根大于1的主成分，其累积方差贡献率达93.755％，对第1、2、3、4主成分影响最大的峰分别为18、5、4、16号共有峰。因此，可确定4个主成分大小的主要共有峰为18(五味子酯甲)、5、4(特女贞苷)、16号峰。表4 主成分与共有峰之间的相关矩阵分析(2)六味五灵片不同比例组合提取物的抗肝纤维化活性测定a.试液的处理精密吸取10μL DMSO，分别加至“步骤二：(1)c.”项下供药效实验的20份已挥干溶剂的提取物里，漩涡振荡，用移液枪分别定量加入1990μL的RPMI‑1640空白培养基，漩涡振荡，超声处理15min，用0.22μm微孔滤膜滤过，除菌，备用。随机选取其中4份续滤液，加入4倍体积的含5％胎牛血清的RPMI‑1640培养基，依此操作，逐步稀释成5个不同浓度梯度的提取液。空白对照同上述处理方式，依次加入DMSO、RPMI‑1640空白培养基、含5％胎牛血清的RPMI‑1640培养基，得5个不同浓度梯度的空白对照液。7个对照品的处理同上述处理方式，得终浓度分别为10，2，0.4，0.08，0.016μg/mL的5个不同浓度梯度的对照液。阳性对照为秋水仙碱，同上述处理方式，终浓度为20μg/mL。b.试液浓度的考察待复苏后的LX‑2细胞处于对数生长期时，用胰酶消化，计数，培养液悬浮细胞。以每孔200μL、每孔细胞总数约5×104个接种于96孔板中，培养24h待细胞贴壁良好后，弃去培养基，分别加入“步骤二：(2)a.”项下4份5个浓度梯度的提取液、5个浓度梯度的空白对照及20μg/mL秋水仙碱各200μL，每组设5个复孔。孵育48h后，吸去上清液，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，继续孵育4h后，吸去上清液，每孔加入200μL的DMSO，平板振荡器振荡10min，使蓝紫色晶状物充分溶解。用酶联免疫检测仪以492nm波长测定吸光度A，计算细胞增殖抑制率，抑制率＝(A空白对照‑A给药组)/A空白对照，实验重复3次，结果见图4。5个浓度的空白对照吸光度值无显著性差异，表明上述比率的DMSO对细胞增殖无影响，5个浓度梯度的4份提取液对LX‑2的抑制作用呈浓度依赖型，秋水仙碱的抑制率为(72.39±2.67)％。故最终选择5mg/mL(相当于总生药)的提取液进行药效试验。c.六味五灵片不同比例组合提取物对LX‑2细胞活性评价将对数生长期的LX‑2细胞均匀接种于96孔培养板，待24h细胞单层铺满孔底后，操作同“步骤二：(2)b.”，依次加入“步骤二：(2)a.”项下20个配伍组合的提取液、不同浓度梯度的7种对照液、秋水仙碱及空白对照液，每组设5个复孔，经MTT，DMSO处理后，492nm下测定A值，计算细胞增殖抑制率，实验重复3次。结果见表2及图5。由图5可知，7种对照品对LX‑2细胞均有抑制作用，且呈现良好的剂量依赖性，其中五味子酯甲在各浓度下对LX‑2细胞的抑制作用均最大，其次五味子甲素，五味子醇甲与五味子乙素的抑制作用接近，4种木脂素的效果优于特女贞苷、连翘苷及连翘酯苷A，与处方中南五味子为君药基本符合。(3)谱效关系分析以六味五灵片20个不同比例组合提取物的指纹图谱为发明对象，利用SPSS 19.0统计软件对各特征共有峰与其抗肝纤维化活性的关系进行相关分析，其中“**”、“*”分别表示P≤0.01、0.01＜P≤0.05，结果见表2；20个不同比例组合的提取物对LX‑2细胞均有抑制作用，其中第3组合的抑制效果最好，23个特征峰中14(五味子醇甲)，20(五味子甲素)，17，19，21号峰与药效关联度较大，18(五味子酯甲)，22号(五味子乙素)，23号峰关联度居中。步骤三：结果六味五灵片20个不同比例组合提取物的HPLC指纹图谱有23个共有峰，本发明对共有峰进行了药味归属及部分色谱峰的定位；采用主成分分析法比较了化学成分对药效的贡献大小，结果显示决定4个主成分大小的主要共有峰多来源于女贞子、连翘、莪术、五味子，分别为4(特女贞苷)、5、16、18号(五味子酯甲)峰，表明上述特征峰为六味五灵片抗肝纤维化作用的主要活性成分；为进一步确定各成分与药效间的关联性，本发明选择了双变量相关分析进行研究，结果表明多成分与抗肝纤维化关联度较大，药效成分是多成分共同作用的结果，14(五味子醇甲)，20(五味子甲素)，17，19，21号峰与药效关联度较大，18(五味子酯甲)，22号(五味子乙素)，23号峰关联度居中；但从图5的结果可知，五味子酯甲对照品在相同浓度下对LX‑2细胞的抑制作用最好，而谱效关系的结果显示其与药效的关联度不及五味子醇甲，原因是复方药效是多成分间共同作用的结果，五味子酯甲的抗纤维化活性有所下调；综合上述分析六味五灵片抗肝纤维化作用的药效物质多来源于五味子，女贞子，连翘，莪术，其中4(特女贞苷)、14(五味子醇甲)、18(五味子酯甲)、20(五味子甲素)、22(五味子乙素)是其部分的药效物质。