[发明专利]一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法

摘要

本发明公开了一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，通过同位素标记相对和绝对定量蛋白质组学技术筛选早期心肌梗死疾病患病人群血清中差异表达的蛋白质，通过对两组标记后的血清样品的质谱结果进行单样本T检验分析，找到6个高表达的蛋白，1个为正常组中高表达，5个为早期心肌梗死疾病组中高表达。其中，在疾病组中Leucine‑rich alpha‑2‑glycoprotein蛋白覆盖度和唯一肽段数最高，通过肽段数据的分析证实其肽段也存在显著差异，经过基因本体功能注释分析发现此蛋白可能与血栓形成等过程相关。本发明方法具有分辨率高、通量大、速度快等优势，为此类疾病蛋白标志物的筛选开辟了一条新的途径。

主权项

1.一种iTRAQ技术筛选心肌梗死疾病表达蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取正常组与心肌梗死疾病组血清，组内随机合并，将合并后样品使用去人血清高丰度柱依次去除各组高丰度蛋白质，低丰度蛋白质组分超滤浓缩后，进行蛋白质定量，将制备好的蛋白质样品进行分装，‑80℃保存备用；(2)取2组8个蛋白质样本各取250μg，各组加入等体积的蛋白质裂解液，沸水浴4～6min，冷却至室温；加入200μL尿素缓冲液混匀，转入10kd超滤离心管，离心14～16min；加入200μL尿素缓冲液离心14～16min，弃滤液；加入100μL碘乙酰胺缓冲液，600rpm振荡1min，避光室温25～35min，离心9～11min；加入100μL尿素缓冲液，离心9～11min重复2次；加入100μL标记缓冲液，离心9～11min，重复2次；加入40μL胰蛋白酶缓冲液，600rpm振荡1min，37℃16～18h；换新收集管，离心9～11min，取滤液，OD₂₈₀肽段定量；所述尿素缓冲液为8M尿素、150mM三羟甲基氨基甲烷‑盐酸的混合物，pH为8.0；所述碘乙酰胺为50mM碘乙酰胺溶液；所述胰蛋白酶缓冲液为5μg胰蛋白酶溶解于40μL的标记缓冲液；(3)取等量的肽段进行同位素标记，标记方案如下：正常组1‑113，正常组2‑114，正常组3‑115，正常组4‑116，疾病组1‑117，疾病组2‑118，疾病组3‑119，疾病组4‑121；(4)分别取所有标记样品合并，合并样品进行离子交换色谱柱分级，收集穿流及洗脱，根据离子交换色谱柱色谱图合并，冻干后C18脱盐柱脱盐；(5)样品采用纳升流速高效液相系统进行分离，上样量为5μL，缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液，乙腈为84％，色谱柱以95％的A液平衡；样品由自动进样器上样到上样柱，再经分析柱分离，流速为400nL/min，相关液相梯度如下：0～100min，B液线性梯度从0～35％；100～108min，B液线性梯度从35～100％；108～120min，B液维持在100％；样品经毛细管高效液相色谱分离后用质谱仪进行质谱分析，分析时长120min，检测方式正离子，母离子扫描范围300～1800m/z，一级质谱分辨率70000at m/z 200，进入离子阈值：3e6，一级最大灌注时间20ms，扫描范围数量：1，动态排除时间：40.0s；多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描后采集10个碎片图谱(MS²scan)，MS²碎裂方式：高能碰撞裂解，分离度窗口：2m/z，二级质谱分辨率：17500at m/z 200，微扫描：1，二级最大灌注时间：60ms，碰撞能量：27eV；(6)将得到的数据，进行数据处理。