[发明专利]筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法

摘要

本发明公开了一种筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，采用LC/MS仪器分别对实验组A和对照组B的血清样本进行代谢组学分析，对所有样本中物质的峰的响应强度数据进行模型判别分析，分别对实验组A和对照组B进行PCA分析，并在此基础上进行PLS‑DA、OPLS‑DA的模型构建，从而获得差异性表达代谢物，筛选并鉴定与乳腺癌发生、转移相关的生物标志物：溶血性卵磷脂、鞘磷脂和小分子氨基酸。其结果对于阐明三阴性乳腺癌患者血清特征性代谢物含量变化规律以及代谢物在肿瘤的发生发展过程中的作用具有重要的意义；同时应用此筛选方法可以获得有效的乳腺癌早期诊断靶点，并为建立特异性癌症诊断模型提供数据基础。

主权项

1.筛选三阴性乳腺癌特异性血清代谢标志物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)选取多个三阴性乳腺癌女性患者血清作为实验组A；选取与实验组A数量相等的正常女性血清作为对照组B；(2)室温解冻实验组A和对照组B的血清后，分别精准吸取100μL血清样本在不同的1.5mLEP管中，采用甲醇沉淀蛋白，甲醇为HPLC级甲醇，其比例为样品：甲醇＝1:4，涡旋30s，进行4℃，12000rpm离心15min，吸取200μL上清液，转入进样小瓶中待检测；(3)将不同血清样本的小瓶分别放置在LC-Q/TOF-MS实验仪器的分析平台上进行色谱分离和质谱检测；色谱分离条件为：柱温为40℃，流速0.35mL/min；流动相组成：①实验组A为：水+0.1％甲酸，其中，水为蒸馏水；②对照组B为：乙腈+0.1％甲酸；进样量为4μL，自动进样器温度4℃；质谱条件：①采用正离子模式进行检测条件：以氮气作为雾化、锥孔气；飞行管检测模式V型，毛细管电压4kV、锥孔电压35kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度350℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气600L/h、萃取锥孔4V；②负离子模式条件：毛细管电压3.5kV、锥孔电压50kV、离子源温度100℃；脱溶剂气温度300℃、反向锥孔气流50L/h、脱溶剂气700L/h、萃取锥孔4V；离子扫描时间0.03s、扫描时间间隔0.02s、数据采集范围：50-1000m/z；(4)通过Mass Profiler软件对LC-Q/TOF-MS实验仪器获得的LC/MS数据进行预处理，并在EXCEL 2010软件中进行后期编辑，将最终结果组织为二维数据矩阵，包括变量、观察量和峰强；然后将所有数据归一化到总信号积分；(5)将编辑后的数据矩阵导入SIMCA-P软件进行主成分分析，获得正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值和Q2值，R2X值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(6)采用监督性的偏最小二乘方判别分析PLS-DA对两组样本进行分析，其模型质量参数为：正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值、R2Y值和Q2值；R2X值为模型的解释率，R2Y值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(7)进一步采用监督式方法OPLS-DA进行建模分析，获得正模式下的主成分和负模式下的主成分累积R2X值、R2Y值和Q2值，R2X值为模型的解释率，R2Y值为模型的解释率，Q2值为模型的预测率；(8)采用OPLS-DA模型的VIP值，并结合t-test的p值来寻找差异性表达代谢物，其中，VIP值即阈值，且阈值>1，p＜0.05；差异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库，比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass；筛选并鉴定与三阴性乳腺癌发生、转移相关的生物标志物为：溶血性卵磷脂和小分子氨基酸，所述溶血性卵磷脂为LysoPC(0:0/18:0)、LysoPC(15:0)、LysoPC(16:0)、LysoPC(16:1(9Z))、LysoPC(18:0)、LysoPC(18:1(11Z))、LysoPC(18:3(6Z,9Z,12Z))、LysoPC(18:4(6Z,9Z,12Z,15Z))、LysoPC(20:1(11Z))、LysoPC(20:2(11Z,14Z))、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z))和LysoPC(22:5(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z))中的任意一种或多种，所述小分子氨基酸为Creatine、L-Proline、L-Threonine、L-Valine、L-Leucine、L-Tryptophan、L-Tyrosine和N-Acetyl-L-Histidine中的任意一种或多种。