[发明专利]一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用

摘要

本发明公开了一种基于Ion Proton^TM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用，构建过程包括血液游离DNA提取、末端修复、片段选择、接头连接、磁珠纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序等步骤。本发明还提供一种用于构建基于Ion Proton^TM测序平台的血液游离DNA文库的血液游离DNA提取试剂、末端修复试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂。本发明明显提高了孕妇血浆胎儿游离DNA的提取浓度，且步骤简单，成本低，提高了建库的成功率；优化后的文库构建体系更利于操作，节省成本，且更换磁珠后，纯化回收效率更高；文库扩增也不需凑够样本量和二次检测，操作更加简单。本发明方法更适用于胎儿染色体非整倍体无创产前诊断。

主权项

一种基于Ion Proton^TM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)血液游离DNA提取：采用磁珠法提取样品中的血液游离DNA；(2)末端修复：将步骤(1)所得到的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA；(3)片段选择：利用磁珠对步骤(2)所得到的平末端DNA进行片段大小筛选并进行磁珠纯化；(4)接头连接：将步骤(3)所得到的DNA片段与接头连接反应试剂、接头、标签接头混合进行接头连接反应；(5)磁珠纯化：将步骤(4)所得到的反应产物利用磁珠进行纯化；(6)文库扩增：将步骤(5)纯化后的DNA片段加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再利用磁珠进行纯化，得到血液游离DNA文库；(7)文库检测：将步骤(6)所得到的血液游离DNA文库采用Qubit和Agilent Bioanalyzer2100检测文库浓度及文库片段大小；(8)高通量测序：基于Ion Proton^TM测序平台，将步骤(7)中所得到的不同血液游离DNA文库样本等浓度混样进行高通量测序；其中，步骤(1)所述样品为孕12‑24周的孕妇血浆；步骤(1)采用试剂盒提取血液游离DNA，所述试剂盒为血清游离DNA提取试剂盒；步骤(2)中进行末端修复时所用的末端修复试剂pH值为7.4‑7.6，溶剂为水，溶质为：5‑15mM的Tris‑HCl缓冲溶液、40‑60mM的NaCl溶液、8‑12mM MgCl₂、2‑4mM二硫苏糖醇、8‑12mM ATP、8‑12mM dNTPs混合液，末端修复酶为8‑12U/μl的End Repair酶；步骤(3)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠；步骤(4)中接头连接反应试剂由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300‑500U/μl的T₄DNA Ligase和6‑10U/μl的Nick Repair DNA Polymerase；连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH7.8‑8.2、40‑60mM的Tris‑HCl缓冲溶液、8‑12mM的KCl、8‑12mM二硫苏糖醇、0.5‑2mM的ATP、1‑3nM的dNTPs混合液、8‑12mM的(NH₄)₂SO₄、1‑3mM的MgSO₄；步骤(5)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠；步骤(6)中扩增试剂pH值为7.5‑7.7，溶剂为水，溶质为：1‑3U/μlPCR SuperMix High Fidelity、pH 8.8‑9.0的64‑68mM的Tris‑SO₄、15‑25mM的(NH₄)₂SO₄、1‑3mM的MgSO₄、200‑250μM dNTPs混合液；步骤(6)中所用磁珠为Agencourt AMPure XP磁珠。