[发明专利]表达DHAV-1和DHAV-3型VP1基因的NDV重组病毒及其应用

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种共表达DHAV‑1型和DHAV‑3型的VP1基因的NDV重组病毒。所述重组病毒记为rLS‑1VP1‑2A‑3VP1，是将DHAV‑1型和DHAV‑3型VP1基因串联后插入到NDV为载体，经拯救获得的重组病毒。本发明所述重组病毒选择NDV(Lasota株)为载体，将DHAV‑1型和DHAV‑3型的VP1基因串联后插入到NDV(Lasota株)为载体，并通过确定DHAV VP1基因插入的最佳插入位点，获得共表达DHAV‑1型和DHAV‑3型的VP1基因的NDV重组病毒，可用于鸭甲肝病毒(1型、3型)和鸭新城疫的预防，弥补当前DHAV‑3疫苗的空白。

主权项

1.一种制备表达DHAV‑1和DHAV‑3型VP1基因的NDV重组病毒的方法，其特征在于，所述表达DHAV‑1和DHAV‑3型VP1基因的NDV重组病毒记为rLS‑1VP1‑2A‑3VP1，是将DHAV‑1型和DHAV‑3型VP1基因串联后插入到NDV为载体，经拯救获得的重组病毒；所述制备方法包括如下步骤：(1)采用SOE‑PCR方法将DHAV‑1型和DHAV‑3型VP1基因进行连接，获得DHAV1VP1‑2A‑3VP1重组基因，具体包括：(1a)分别以DHAV‑1和DHAV‑3为材料，利用RT‑PCR方法分别扩增得到DHAV‑1VP1‑2A基因和DHAV‑3 VP1基因；并以得到的两组PCR回收产物为模板，利用SOE‑PCR方法获得重组基因DHAV‑1VP1‑2A‑3VP1；所述DHAV‑1进行PCR扩增为DHAV‑1VP1‑2A基因的引物P1为：上游引物：5'‑TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG‑3’，下游引物：5'‑CTGATTGGAATCACCTTGATCTGTAGTAAT‑3’，其扩增产物DHAV‑1VP1‑2A的片段大小为1652bp；扩增产物DHAV‑1VP1‑2A的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述DHAV‑3进行PCR扩增为DHAV‑3 VP1基因的引物P2为：上游引物：5'‑ATTACTACAGATCAAGGTGATTCCAATCAGC‑3’，下游引物：5'‑AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT‑3’，扩增产物DHAV‑3 VP1的片段大小为746bp；扩增产物DHAV‑3 VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述DHAV‑1VP1‑2A基因和DHAV‑3 VP1基因进行SOE‑PCR扩增获得重组基因DHAV‑1VP1‑2A‑3VP1基因的引物P3为：上游引物：5'‑TGGAATTCGGTGATTCTAACCAGTTG‑3’，下游引物：5'‑AATGCGGCCGCTTCAATYTCCARAT‑3’，扩增产物DHAV‑1VP1‑2A‑3VP1的片段大小为2368bp，扩增产物DHAV‑1VP1‑2A‑3VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；(1b)将回收的PCR产物，连接至pMD18‑T‑Vector，经EcoR I/Not I双酶切鉴定，鉴定正确的阳性重组子；(2)将DHAV1VP1‑2A‑3VP1基因与LaSota株线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，构建表达DHAV‑1VP1‑2A‑3VP1的重组NDV病毒载体，筛选出阳性克隆；(3)拯救并获得重组病毒rLS‑1VP1‑2A‑3VP1。