[发明专利]检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法

摘要

本发明提供了检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法。具体步骤如下：A、收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度；D、测定精子唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。通过精子中唾液酸酶活性的检测，为临床原因不明的男性不育患者提供诊断依据及临床咨询。

主权项

1.检测精子中唾液酸酶的试剂盒的使用方法，其特征在于：试剂盒包括细胞裂解液，磷酸缓冲液或者BWW培养液，蛋白酶抑制剂Cocktail，试剂A液，试剂B液，牛血清白蛋白，荧光试剂，唾液酸酶标准原液和检测缓冲液；所述细胞裂解液不含酶活抑制剂；所述的试剂A液为：1％BCA二钠盐，2％无水碳酸钠，0.16%酒石酸钠，0.4％氢氧化钠，0.95％碳酸氢钠，混合调pH值至11.2‑11.3；试剂B液为：4％硫酸铜；所述的检测缓冲液为含0.05 mmol/l 乙酸钠和0.25μg/μl牛血清白蛋白的磷酸缓冲液；所述的荧光试剂是2′‑4‑甲基伞形酮基‑α‑D‑N‑乙酰神经氨酸钠；所述的唾液酸酶标准原液为产气荚膜梭菌唾液酸酶，浓度为5U/ml；试剂盒的使用方法，具体步骤如下：A、精子的洗涤收集新鲜液化精液标本，用磷酸缓冲液或者BWW培养液洗涤精子，充分除去残留的精浆成分，再离心分离出精子；B、提取精子蛋白向A步骤分离出的精子中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂cocktail，混匀，待无明显的细胞沉淀即充分裂解，在4℃下高速离心，上清液即蛋白提取物；C、测定精子蛋白提取物的蛋白浓度（1）用细胞裂解液配制牛血清白蛋白的蛋白标准原液，再用裂解液按2/1.0/0.5/0.25/0.125mg/ml的浓度梯度将蛋白标准原液稀释为蛋白标准溶液，向检测板内依次加入各蛋白标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入裂解液稀释；（2）按A:B=50：1的体积比配制试剂A液和B液的混合液，将其加入上述各蛋白标准溶液和待测样本的孔内，轻轻混匀，将检测板置于37℃反应30min，然后用酶标仪读取各孔吸光度，根据蛋白标准曲线计算出待测样本的蛋白浓度；D、测定精子唾液酸酶活性（1）用检测缓冲液将唾液酸酶标准原液按5/2.5/1.25/0.625/0.312 mU/ml的浓度梯度将其稀释为唾液酸酶标准溶液，向检测板内依次加入各唾液酸酶标准溶液；加入待测样本于检测板内，再加入检测缓冲液稀释；（2）用检测缓冲液稀释荧光试剂，将其加入上述各唾液酸酶标准溶液和待测样本的孔内，再将检测板置于37℃避光孵育1‑2小时后，用酶标仪读取各孔荧光强度，根据唾液酸酶活性标准曲线计算出待测样本的唾液酸酶活性，最后得出唾液酸酶活性/蛋白浓度的值即可。