[发明专利]腮腺炎病毒抗体双抗原夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法

摘要

本发明公开了一种腮腺炎病毒抗体双抗原夹心法免疫胶体金检测试纸条及其制备方法，是将病毒抗原及其胶体金标记的抗原，分别固定在硝酸纤维素膜和玻璃纤维素膜上，组成该试纸条。试纸条由样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜及PVC底板4部分组成，样品垫用玻璃纤维素膜。在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，以纯化病毒抗原在膜上划线作为测试线，以抗病毒多克隆抗体在膜上划线作为控制线。膜上缘粘贴吸水滤纸，下缘粘贴胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫。检测时取血清两滴，滴加在样品垫上，根据测试线和控制线是否出现色带来判断是否存在病毒抗体。本发明具有高特异性，高稳定性，主要供流行病学调查和实验室研究使用。

主权项

腮腺炎病毒抗体双抗原夹心法免疫胶体金检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)腮腺炎病毒纯化抗原制备：将腮腺炎病毒接种于已生长成单层的Vero细胞上，细胞生长液是含10％小牛血清的DMEM培养液，37℃吸附1小时后，倾去接种物，然后加入含1％小牛血清的DMEM维持液，于35℃、5％CO₂培养5～7天，病毒培养液经低速离心除去细胞碎片后，用300kD超滤膜超滤浓缩50倍后，弃去上清，沉淀用0.0lmol/L PBS溶液重溶(PBS：NaCl 8.0g、KH₂PO₄ 0.2g、KCl 0.2g，加双蒸水至1000ml，调至pH7.4)，置‑80℃冻存。用PBS溶液配制10％、20％、30％、40％、50％、60％蔗糖溶液，取上述不同浓度的蔗糖溶液各2ml，在离心管内，按浓度由高到低的顺序，自下而上铺好梯度。取适量浓缩抗原加在铺好梯度的蔗糖溶液上，4℃、100000×g，离心12h，收集40％蔗糖界面上的不透明带为含腮腺炎病毒带。将收集的含腮腺炎病毒带过分子筛层析柱，Elution buffer(50mMNa₂HPO₄ 0.15MNaCl PH7.0)收集病毒峰，最终纯度达95％以上。(2)胶体金的制备：采用柠檬酸三钠还原法，制备30nm的胶体金。具体操作方法如下：取100ml双蒸水，加热至沸腾，加入1ml 1％的氯金酸，搅拌下准确加入1.5ml体积分数为1％的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，30min后停止加热，冷却至室温后4℃避光保存。(3)胶体金标记腮腺炎病毒纯化抗原的制备：用0.2mol/L K₂CO₃将胶体金溶液调到pH8.0。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100ml溶液加入lmg纯化的腮腺炎病毒抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2h，再滴加入到终浓度为0.1％的PEG4000和2％的BSA进行封闭30min，标记结束后以10000r/m离心，弃上清，沉淀物用0.0lmol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经1500r/min离心20min，取上清加至葡聚糖凝胶层析柱纯化，最终纯度达95％以上。沉淀按原体积复溶至胶体金稀释液中(50mmol/L硼酸盐缓冲液，pH8.0，含1％BSA、l％的水解酪蛋白，2％蔗糖，0.1％Tween 20)。然后将标记胶体金溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度20℃～25℃干燥4h，制成胶体金垫，干燥备用。(4)腮腺炎病毒纯化抗原包被硝酸纤维素膜：用0.0lmol/L pH7.4PBS将腮腺炎病毒纯化抗原稀释成lmg/ml，然后用喷膜仪将抗原在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被，同时在硝酸纤维素膜上包被兔抗腮腺炎病毒多克隆抗体，用于产品的质控，包被完成后将硝酸纤维素膜在干燥间干燥6～8h，备用。(5)试纸条的组装：在干燥间内准备好吸水滤纸、样品垫、PVC底板，在PVC底板中央贴上包被好的硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸，硝酸纤维素膜下缘粘贴标记有腮腺炎病毒纯化抗原胶体金垫，胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成产品的组装。