[发明专利]一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法

摘要

本发明公开了一种基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶活性的方法。检测时，DNA糖基化酶hOGG1会特异性识别并切除损伤鸟嘌呤，留下一个脱碱基位点，脱嘌呤核酸内切酶‑1会对脱碱基位点进一步剪切，留下一个核苷酸的缺口，DNA聚合酶β将Cy5‑dGTP聚合在该缺口处，生成双标记的双链核苷酸底物，通过生物素与链霉亲合素之间的特异性反应，DNA底物会结合在覆盖有链霉亲合素的量子点的表面，形成QD‑DNA‑Cy5复合物，空间距离缩小，导致量子点和Cy5之间发生荧光共振能量转移，从而可以在单分子水平观察到Cy5的荧光信号。本发明所述检测方法简单、快速、灵敏，检测下限可达1.8×10^‑6U/μL。

主权项

1.一种非疾病治疗诊断目的的基于单个量子点水平检测DNA糖基化酶hOGG1活性的方法，所述方法包括如下步骤：(1)待测DNA糖基化酶hOGG1介导的双链DNA底物的碱基切除修复：双链DNA底物中加入待测DNA糖基化酶hOGG1、脱嘌呤核酸内切酶‑1、DNA聚合酶β和标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸；所述双链DNA底物为长度25bp的双链DNA，其作为DNA糖基化酶hOGG1底物，该双链DNA的其中一条链3′端修饰一个生物素分子，互补链距离5′端12个碱基处为损伤8‑氧鸟嘌呤，双链DNA的其他碱基不为8‑氧鸟嘌呤；通过DNA糖基化酶hOGG1特异性地识别双链DNA底物中8‑氧鸟嘌呤，并切除8‑氧鸟嘌呤，在双链DNA上留下一个脱碱基位点；脱嘌呤核酸内切酶‑1对脱碱基位点进行剪切，在该位点处留下一个核苷酸的缺口；DNA聚合酶β将标记有Cy5荧光分子的三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸聚合在缺口处，最终生成具有Cy5和生物素双标记的修复反应产物；构成双链DNA底物的两条序列分别为正义链：5'‑CTC CTC CCC CAT CTC CTC CCA GTC C‑biotin‑3'和反义链：5'‑GGA CTG GGA GGA OAT GGG GGA GGA G‑3'，O为8‑氧鸟嘌呤；(2)修复反应产物与量子点混合孵育反应：所述量子点表面覆盖有链霉亲合素；(3)单分子检测Cy5荧光信号，定量分析DNA糖基化酶hOGG1活性：采用全内角反射荧光技术的单分子成像系统进行检测。