[发明专利]一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类种质构建方法及应用

摘要

本发明提供一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法。以半滑舌鳎Dmrt1基因为例，通过构建Dmrt1基因的基因组编辑TALEN质粒，在体外转录为mRNA后转移到半滑舌鳎1‑4细胞期的受精卵动物极，将受精卵培育为成鱼，采用PCR方法从中筛选出基因突变的F0代鱼，从而构建出基因定点突变的成鱼。本发明还提供一种培育基因发生定点突变的海水鱼类新种质的方法，是将上述F0代鱼与野生型鱼杂交，得到杂交子代鱼，然后检测出可遗传突变类型的F0代鱼作为父、母本，进行人工繁殖,筛选出基因双位点突变的F1代鱼，进一步杂交后即可获得纯合突变体系F2代鱼。本发明可使鲆鲽鱼类目的基因发生定点突变，为鲆鲽鱼类基因功能研究和新种质创制提供了一种新的方法。

主权项

一种基于基因组编辑的海水鲆鲽鱼类新种质构建方法，其特征在于，所述的方法包含有如下的步骤：1)基因组编辑TALEN质粒的构建：在基因序列为SEQ ID NO:1的半滑舌鳎Dmrt1基因的外显子1编码区起始密码子ATG下游80‑140个核苷酸的区间选取一对TALEN结合位点，每个结合位点的长度为16‑18bp核苷酸，左右结合位点之间相隔15‑17bp，结合位点序列5′端的起始碱基的上游碱基为T；构建Dmrt1基因的TALEN基因组编辑质粒；其中左边结合位点的序列为SEQ ID NO:4；右边结合位点的序列为SEQ ID NO:5；2)基因组编辑质粒的体外转录：将步骤1)构建的Dmrt1基因组编辑TALEN质粒用限制性内切酶NotI酶切，使其线性化；体外转录成相应的mRNA，并进行纯化；3)体外转录的mRNA向海水鲆鲽鱼类受精卵的转移及受精卵培养：所述的受精卵为处于1‑4细胞期的受精卵；将纯化好的TALEN mRNA转入鲆鲽鱼类受精卵的动物极中，随后将受精卵放入恒定温度的无菌海水中进行培养；4)基因发生定点突变鱼苗的养殖与检测；将存活的受精卵进行孵化培养，待鱼苗长到5‑7厘米时，提取鳍条DNA用作PCR模板，在Dmrt1基因靶位点两端设计PCR引物，进行PCR扩增，做单克隆测序，与野生型鱼的目的基因序列进行比较,筛选出目的基因靶位点突变的鱼苗。