[发明专利]一种猪CD40L/GMCSF/PCV2Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法

摘要

本发明涉及一种猪CD40L/GMCSF/PCV2 Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法，步骤如下：S1依次将CD40L、GM‑CSF和Cap连接到载体pUC57，命名为pUC‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S2将CD40L、Cap和GM‑CSF连到pShuttle‑CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，命名为PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S3将构建好的PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF线性化后与骨架质粒pAdEasy‑1电转BJ5183，挑菌、摇菌、提质粒，单酶切鉴定；S4鉴定正确后使用试剂盒提取质粒，转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌PBS；S5反复冻融后，离心取上清，此病毒即为重组腺病毒；S6将得到的重组腺病毒进行扩增；S7纯化重组腺病毒。本发明首次将猪肿瘤坏死因子相关激活蛋白基因和猪粒细胞‑巨噬细胞集落刺激因子基因同时加入到腺病毒载体中提高表达PCV2 Cap重组腺病毒免疫原性。

主权项

一种猪CD40L/GMCSF/PCV2 Cap重组腺病毒的构建、扩增及纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1依次将CD40L、GM‑CSF和PCV2 Cap蛋白的编码基因连接到载体pUC57，经测序鉴定，命名为pUC‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S2将CD40L、Cap和GM‑CSF连到pShuttle‑CMV：以pUC‑CD40L‑Cap‑GMCSF为模板，用带Xho I上游引物和带EcoR V下游引物进行PCR扩增，得到目的基因CD40L‑Cap‑GMCSF，双酶切后连接到pShuttle‑CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，PCR鉴定和单双酶切鉴定正确后，送测序，测序正确后，命名为PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF；S3将构建好的PS‑CD40L‑Cap‑GMCSF用限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质粒pAdEasy‑1电转BJ5183，挑菌、摇菌、提质粒，用限制性内切酶Pac I单酶切鉴定；S4鉴定正确后使用试剂盒提取质粒，用限制性内切酶Pac I线性化后转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收细胞，离心后将沉淀重悬于高压灭菌PBS；S5反复冻融3次后，离心取上清，此病毒即为原种腺病毒，命名为Ad‑CD40L‑Cap‑GMCSF。S6重组腺病毒的扩增：用收获的Ad‑CD40L‑Cap‑GMCSF病毒液接种已长成单层的HEK293A细胞，待80％以上的细胞出现明显的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE)后收毒，连续传代扩增病毒，收集病毒，并测定各代次病毒滴度，根据CPE，按Reed‑Muench法计算病毒的滴度(50％tissue culture infective dose,TCID₅₀)。S7重组腺病毒的纯化：(1)将15％CsCl和40％CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液；(2)将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl梯度溶液上；(3)超速离心，100000g，4℃，离心16h；(4)离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具感染能力；位置较低，颜色较亮的条带是活病毒颗粒。用针头将这一条带收集；(5)在TBS(10mM Tris，0.9％NaCl，pH 8.1)中透析1h，随后在含有10％甘油的TBS中透析2次，每次1h；(6)将纯化的腺病毒分装于离心管中。