[发明专利]一种二噁英类持久性有机污染物检测方法

摘要

一种二噁英类持久性有机污染物检测方法，涉及一种基因工程。按照设计从斑马鱼染色体DNA上PCR扩增出CYP1A启动子序列，构建含有luciferase基因，TA box的PGL6‑TA‑pCYP1A质粒。通过改造CYP1A启动子，提高重组质粒对TCDD的检测效率，建立了一个快速，高效的检测TCDD以及同样是AHR配体的毒物的系统。利用斑马鱼cyp1a基因启动子序列，利用overlap pcr技术对其进行改造，连接到PGL6‑TA载体中，使改造完成的启动子序列对二噁英类持久性有机污染物的敏感度加强，转染到HepG2细胞中，能够快速检测环境中二噁英类持久性有机污染物。

主权项

一种二噁英类持久性有机污染物检测方法，其特征在于其具体步骤如下：1)以National Center for Biotechnology Information网站上已知的斑马鱼基因组序列为模板设计一对引物pCYP1A‑F,pCYP1A‑R，克隆CYP1A(Chromosome 18‑NC_007129.6)启动子序列，引物序列如下：pCYP1A‑F：5’－AAAGGTACCGAAACCCACGCCATGCAAAC－3’                 Kpn IpCYP1A‑R：5’－AAAAAGCTTTCCTCCGCGTGACGTCACCG－3’                Hind III其中在CYP1A启动子序列的上游引物设置了Kpn I酶切位点，在下游引物设置了Hind III酶切位点，以斑马鱼基因组为模板，以上述两条引物，利用PCR技术扩增出启动子序列：该启动子序列位于CYP1A基因的表达起始密码子ATG的上游314个碱基；将扩增出来的片段经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A，将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；2)用得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A为模板，设计引物pCYP1A‑2×DRE‑F,pCYP1A‑2×DRE‑R，进行overlap PCR，对启动子序列进行改造，引物序列如下：2×DRE‑1F：5’‑TGTTACATACATCAATCTCC‑3’2×DRE‑2F：5’‑ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGTGTTACATACATCAATCTCC‑3’                       芳香烃受体结合位点2×DRE‑1R：5’‑CACGCACACATACATGGTAC‑3’2×DRE‑2R：5’‑CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCACACATACATGGTAC‑3’改造后序列示意：以pCYP1A‑F，2×DRE‑1R为引物，PGL6‑TA‑pCYP1A为模板，PCR扩增扩增出序列1；2×DRE‑1F，pCYP1A‑R为引物，PGL6‑TA‑pCYP1A为模板，PCR扩增扩增出序列2；pCYP1A‑F，2×DRE‑2R为引物，序列1为模板，PCR扩增扩增出序列3；2×DRE‑2F，pCYP1A‑R为引物，序列2为模板，PCR扩增扩增出序列4；以pCYP1A‑F，pCYP1A‑R为引物，模板同时加入序列3和序列4，扩增出目的序列pCYP1A‑2×DRE，先将目的序列克隆到T载体中，经测序得到正确的改造序列，用得到的质粒经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE，将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE送到生工公司以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；3)用得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE为模板，设计引物3×DRE‑F,3×DRE‑R，进行overlap PCR，对启动子序列进一步改造；引物序列如下：3×DRE‑F：5’－ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTGTGTTACATACATCAAT－3’3×DRE‑R：5’－CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCACACATACATGGTAC－3’改造后序列示意：以pCYP1A‑F，3×DRE‑R为引物，序列3为模板，PCR扩增出序列5；3×DRE‑F，pCYP1A‑R为引物，序列4为模板，PCR扩增扩增出序列6；以pCYP1A‑F，pCYP1A‑R为引物，模板同时加入序列5和序列6，扩增出目的序列pCYP1A‑3×DRE；先将目的序列克隆到T载体中，经测序得到正确的改造序列，用得到的质粒经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑3×DRE；将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑3×DRE送到生工公司以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；4)用得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑3×DRE为模板，设计引物4×DRE‑F,4×DRE‑R，进行overlap PCR，对启动子序列进一步改造；引物序列如下：4×DRE‑F：ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTG4×DRE‑R：CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGT改造后序列示意：引物序列如下：4×DRE‑F：ACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTGACTGCGAGCCCCCTCGCGTG4×DRE‑R：CACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGTCACGCGAGGGGGCTCGCAGT以pCYP1A‑F，4×DRE‑R为引物，序列5为模板，PCR扩增出序列7；3×DRE‑F，pCYP1A‑R为引物，序列6为模板，PCR扩增扩增出序列8；以pCYP1A‑F，pCYP1A‑R为引物，模板同时加入序列7和序列8，扩增出目的序列pCYP1A‑4×DRE；先将目的序列克隆到T载体中，经测序得到正确的改造序列，用得到的质粒经Kpn I/Hind III双酶切后回收序列片段，并与经Kpn I/Hind III双酶切的实验室原有的质粒载体PGL6‑TA连接，连接产物转化E.coliDH5α，以氨苄青霉素(Amp)筛选克隆子，得重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑4×DRE，将得到的重组质粒PGL6‑TA‑pCYP1A‑4×DRE以Rvprimer3通用引物进行测序，进一步验证得到质粒序列的准确性；5)改造的重组质粒的脂质体转染和筛选：利用Promega公司的ViaFect^TM Transfection Reagent将PGL6‑TA‑pCYP1A，PGL6‑TA‑pCYP1A‑2×DRE，PGL6‑TA‑pCYP1A‑3×DRE，PGL6‑TA‑pCYP1A‑4×DRE转进HepG2细胞中，并用1nM TCDD处理24h，利用Promega公司Dual‑Reporter Assay System检测试剂盒检测luciferase表达水平，判定改造的重组质粒对毒物检测效率的大小。