[发明专利]一种构树叶片蛋白质分离方法

摘要

本发明公开了构树叶片蛋白质分离方法。本发明所提供的方法可用于分离所有植物叶片蛋白质，具体是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离，包括如下步骤：a)将待分离的植物叶片蛋白质样品进行第一向等电聚焦电泳；b)待第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条，进行胶条平衡；c)将平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；d)待第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，对染色结果进行扫描及图像分析，完成植物叶片蛋白质的分离。使用本发明所述方法分离植物叶片蛋白，有利于了解植物光合作用的重要部位——叶片，为运用生物技术手段进一步改良品种，提高植物品质打下基础。

主权项

1.一种植物叶片蛋白质的分离方法，是采用蛋白质双向聚丙烯酰胺凝胶电泳进行植物叶片蛋白质的分离，其特征在于：所述方法包括如下步骤：(a)将待分离的植物叶片蛋白质样品进行第一向等电聚焦电泳；(b)待步骤(a)的第一向等电聚焦电泳结束后取出胶条，进行胶条平衡；(c)将经步骤(b)平衡后的胶条进行第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；(d)待步骤(c)的第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色，对染色结果进行扫描及图像分析，完成植物叶片蛋白质的分离；步骤(a)中，所述待分离的植物叶片蛋白质样品为采用TCA/丙酮沉淀法获得的来自于所述待分离的植物叶片的蛋白质干粉；步骤(a)中，进行所述第一向等电聚焦电泳的方法包括如下步骤：(a1)将pH4‑7且长度9‑12cm的IPG预制胶条浸泡在180‑250微升含有0.5‑1.0毫克所述待分离的植物叶片蛋白质样品的溶液中，12小时后取出所述IPG预制胶条；(a2)将经过步骤(a1)处理的所述IPG预制胶条按照如下条件进行等电聚焦电泳：20℃恒温，按顺序在300V、600V和1000V电压下分别电泳0.6‑1.5小时，然后在30‑90分钟内线性升压至8000V，再在8000V电压下电泳4‑6小时；步骤(b)中，进行所述胶条平衡的方法包括如下步骤：(b1)将所述胶条在pH8.6的平衡缓冲液A中平衡15分钟后取出所述胶条；(b2)将经过步骤(b1)处理的所述胶条转入pH8.6的平衡缓冲液B中平衡15分钟；所述pH8.6的平衡缓冲液A的溶剂为水，溶质及浓度如下：8‑12g/L二硫苏糖醇、5‑7M尿素、250‑350g/L甘油、15‑25g/L十二烷基硫酸钠、40‑60mM Tris‑HCl；所述pH8.6的平衡缓冲液B的溶剂为水，溶质及浓度如下：20‑30g/L碘乙酰胺、8‑12g/L二硫苏糖醇、5‑7M尿素、250‑350g/L甘油、15‑25g/L十二烷基硫酸钠、40‑60mM Tris‑HCl；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，采用的浓缩胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量为3％‑6％，采用的分离胶中聚丙烯酰胺的质量百分含量为10％‑20％；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时，按照包括如下步骤的方法制备电泳胶：先在灌胶模具中灌入所述分离胶，静置直至所述分离胶凝固，接着灌入所述浓缩胶，得到垂直胶板，位于所述垂直胶板上部的所述浓缩胶的高度为1‑3cm，位于所述垂直胶板下部的所述分离胶的高度10‑15cm；步骤(c)中，进行所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法包括如下步骤：将经步骤(b)平衡后的胶条放在所述电泳胶的顶端，用质量百分含量为0.8‑1.2％的琼脂糖溶液密封后置于电泳槽上，在电泳槽中加满电极缓冲液后，先在电流为3mA‑5mA的条件下预电泳15‑35分钟，然后在电流为30mA的条件下电泳2.5‑4小时，完成所述第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中，所述电极缓冲液的溶剂为水，溶质及浓度如下：质量百分含量为0.2％‑0.5％的Tris、质量百分含量为1.0％‑1.6％的甘氨酸、质量百分含量为0.05％‑0.15％的SDS；所述植物为构树。