[发明专利]一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法

摘要

本发明公开了一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，1)用胰酶液消化MDCK 细胞，得到细胞悬液并进行细胞计数后接种于含有DMEM培养基的转瓶中，37℃培养；2)转瓶中的细胞数增长到3‑4倍时，用PBS洗涤细胞面后，加入细胞维持液同时接种禽流感病毒，35℃继续培养，收获细胞培养物，反复冻融得到细胞毒液；3)细胞毒液内加入甲醛和吐温‑80，于37℃下灭活20‑24h；4)将灭活后的细胞毒液与油相按体积比1:1.8‑2.2混合乳化，得到油包水型禽流感病毒灭活疫苗。本发明可稳定生产禽流感病毒，可避免外源性病原污染，所生产的禽流感病毒效价高，制备成灭活疫苗后免疫效果良好。

主权项

一种禽流感病毒灭活疫苗的制备方法，其特征在于：其包括以下步骤：1) 制苗用细胞的培养 ：取生长良好的 MDCK 细胞转瓶，经0.02%的EDTA液洗涤后，用0.20‑0.25%的胰酶液消化MDCK 细胞，得到细胞悬液并进行细胞计数，然后按3 ‑4×10⁵/mL 的细胞密度将细胞悬液接种于含有5‑6%新生牛血清的DMEM培养基的转瓶中，于37℃条件下培养；2) 病毒培养与收获：上述转瓶中的细胞数增长到3‑4倍时，用pH7.4的磷酸盐缓冲液洗涤细胞面3‑4次后，加入细胞维持液，同时接种禽流感病毒；所述细胞维持液为含终浓度2.5‑5.0ug/mL胰酶的DMEM培养液，接种的禽流感病毒在细胞维持液中的终浓度为10‑100TCID₅₀/mL；然后将转瓶在 35℃继续培养40‑48h，细胞100%病变并脱落时收获细胞培养物，反复冻融3次，得到细胞毒液；3) 病毒的灭活 ：将上述得到的细胞毒液置于灭菌容器内，在细胞毒液内加入甲醛溶液和吐温‑80，所述甲醛溶液在细胞毒液内的体积终浓度为1‰，所述吐温‑80在细胞毒液内的体积终浓度为4%，充分摇匀细胞毒液，置于37℃条件下灭活20‑24小时；4) 疫苗的制备：将白油、吐温80、硬脂酸铝按92‑94:5‑6:2的重量比混合配制得到油相，将上述灭活后的细胞毒液与油相按体积比1:1.8‑2.2混合乳化，得到油包水型禽流感病毒灭活疫苗。