[发明专利]一种构建酵母多拷贝表达载体的方法

摘要

本发明公开了一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，首先选取具有目标基因的第一载体和第二载体，然后利用一对同尾酶和一个参考酶对第一载体和第二载体进行酶切，获得具有目标基因的子序列和母序列，获得具有参考片段的目标载体，最后利用参考片段进行快速筛选，获得所述多拷贝表达载体。通过本发明，能快速准确的构建含有特定拷贝数和特定基因的多拷贝数载体，降低了常规构建多拷贝表达载体方法中表达盒连接方向随机、载体直连或者酶切过程不充分等产生假阳性因素的概率，操作简单，效率高。

主权项

1.一种构建酵母多拷贝表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选取第一载体和第二载体：所述第一载体包括第一表达盒以及参考片段，所述第二载体包括第二表达盒以及参考片段；所述第一表达盒具有m个第一目标基因，所述第二表达盒具有n个第二目标基因，m和n为大于等于1的整数；所述参考片段具有能被参考酶酶切的参考酶切位点，所述参考酶切位点在所述第一载体和第二载体的基因序列上都为唯一序列；在所述第一载体上，所述参考片段的3’端至所述第一表达盒的5’端之间具有能被第一酶酶切的第一酶切位点，且所述第一酶切位点在所述第一酶切位点的下游端以及所述参考酶切位点的上游端之间唯一；在所述第二载体上，所述第二表达盒的3’端至所述参考片段的5’端之间具有能被第二酶酶切的第二酶切位点，且所述第二酶切位点在所述参考酶切位点的下游端以及所述第二酶切位点的上游端之间唯一；所述第一酶以及第二酶为同尾酶；所述第一酶切位点与参考酶酶切位点之间的距离以及第二酶切位点与参考酶酶切位点之间的距离大于或等于100bp；(2)利用第一酶和参考酶酶切第一载体，回收所述第一酶切位点的下游端以及所述参考酶切位点的上游端之间的基因序列为子序列；同时，利用第二酶和参考酶酶切第二载体，回收所述参考酶切位点的下游端以及所述第二酶切位点的上游端之间的基因序列为母序列；(3)连接子序列与母序列，使得所述子序列的第一酶切位点的下游端与所述母序列的第二酶切位点的上游端连接，所述子序列的参考酶切位点的上游端与所述母序列的参考酶切位点的上游端连接，获得目标载体；(4)筛选出具有参考片段的目标载体，获得具有m个第一目标基因以及n个第二目标基因的所述多拷贝表达载体。