[发明专利]一种DNA分子克隆方法

摘要

以长引物和PCR为基础的分子克隆技术具有操作简单、效率高、成本低的优点。随着高保真DNA聚合酶的出现，基于PCR的分子克隆方法越来越广泛地被使用。本发明涉及一种嵌合体构建和片段插入的分子克隆策略,首次命名为MP克隆(mega primer cloning)。该方法包括以下几步：1)长引物的PCR扩增。2)长引物参与的第二轮PCR扩增。3)PCR产物DpnI消化并转化到大肠杆菌感受态中。PCR产物的纯化可以显著的提高MP克隆的效率。实验证明，这种方法是一种简单有效的分子克隆工具。

主权项

1.一种DNA分子克隆方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)进行嵌合体构建的引物设计：构建基因1和基因2的嵌合体时：设以下2组引物：F1、R1、F2、R2，各引物全长在60bp以内，其中F1和R1对应扩增的目的基因为基因1，F2和R2对应的目的基因为基因2；F1和R2的3’端分别与各自的目的基因同源，F1和R2的5’端分别与目的载体同源；F2和R1的3’端分别与各自的目的基因同源，F2的5端与基因1有部分同源，R1的5端与基因2有部分同源，F2和R1完全反向互补；F1、R1、F2、R2的T_m值为50—80℃；当构建两个以上基因的嵌合体时，也同时遵守以上原则；(2)酶链聚合反应：在第一轮PCR中，基因1由F1和R1扩增，得到长引物M1和M2，基因2由F2和R2扩增，得到长引物M3和M4；切胶回收第一轮扩增产物M1、M2、M3和M4；在第二轮PCR中，以第一轮PCR产物M1、M2、M3、M4作为长引物，以目的载体为模版进行扩增；将第二轮PCR产物纯化后，用DpnI酶消化以去除模板；(3)转化：将DpnI酶消化后的第二轮PCR产物转化受感态大肠杆菌并涂于含氨卞青霉素的LB琼脂平板皿上培养；(4)挑选平板上长出的菌落，进行菌落PCR，电泳检测是否得到目的基因1和2。