[发明专利]胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法

摘要

本发明公开了一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，从水稻基因组中克隆OsMADS7基因的特异性干扰片段，利用水稻谷蛋白基因的启动子构建胚乳特异性干扰载体，通过根癌农杆菌介导方法，将干扰载体转入水稻基因组中，并对转基因植株进行基因表达鉴定和表型分析。本发明的有益效果为：本发明成功获得了一个高温响应的转录因子OsMADS7，野生型水稻品种中该基因的表达可以受高温诱导，通过胚乳特异性干扰OsMADS7的表达，我们发现转基因水稻株系的直链淀粉含量对高温具有更强的耐受性，且不影响水稻的其它重要农艺性状，从而为人们有效维持高温下稻米的品质提供了一定的有效途径，填补相关领域的技术空白。

主权项

1.一种胚乳特异性下调OsMADS7基因的表达提高稻米直链淀粉含量对高温的耐受性的方法，其特征在于:从水稻基因组中克隆OsMADS7基因的特异性干扰片段，利用水稻谷蛋白基因的启动子构建胚乳特异性干扰载体，通过根癌农杆菌介导方法，将干扰载体转入水稻中，并对转基因植株进行基因表达鉴定和表型分析；具体包括以下步骤：(1)根据OsMADS7基因的序列设计引物，扩增该基因的特异性干扰片段；特异性干扰片段利用引物对MADS7C2‑F6和MADS7C2‑R6进行PCR扩增获得；MADS7C2‑F6的序列为ACTACTAGTGTCGACATTCATCCCTGAAGCACGTC，MADS7C2‑R6的序列为TCTGAGCTCCTGCAGGTGGATGGAAGAACCCATTG；(2)利用水稻谷蛋白基因GluC的启动子构建OsMADS7基因的胚乳特异性干扰载体GlucP‑MADS7‑RNAi；具体为：利用引物对GluCp‑1F和GluCp‑1R进行PCR扩增，获得GluC的启动子；利用HindIII和PstI酶切位点将GluC启动子连入pCAMBIA1301表达载体；利用SacI和PstI酶切位点将载体PTCK303的水稻内含子Rice Intron移入经前面步骤改造后的pCAMBIA1301表达载体获得胚乳特异性干扰载体GlucP‑RNAi；GluCp‑1F的序列为GGGAAGCTTGTTCAAGATTTATTTTTGG，GluCp‑1R的序列为ACGCCTGCAGAGTTATTCACTTAGTTTCCC；分别利用上游的Sal I和Pst I酶切位点，以及下游的Sac I和Spe I酶切位点将上一步获得的OsMADS7特异性干扰片段分别正向和反向连入胚乳特异性干扰载体GlucP‑RNAi获得OsMADS7胚乳特异性干扰载体GlucP‑MADS7‑RNAi；(3)通过根癌农杆菌介导遗传转化方法，将干扰载体转入水稻中；(4)通过分子标记和RT‑PCR方法对水稻的基因型和基因表达进行鉴定；(5)利用蛋白酶消化和紫外分光光度测定方法对高温处理的稻米进行淀粉纯化和直链淀粉含量测定；通过表型分析选择获得直链淀粉含量对高温具有强耐受性，且结实率未受明显影响的转基因水稻株系。