[发明专利]一种检测甘胆酸的荧光增强免疫分析方法及免疫试剂盒

摘要

本发明属于免疫学技术领域，公开了一种检测甘胆酸的荧光增强免疫分析方法及免疫试剂盒。本发明旨在研发甘胆酸检测的荧光增强免疫试剂盒，该试剂盒具有前处理简单、快速准确、成本低廉、稳定，可用于现场大批量检测等特点。本发明通过甘胆酸包被抗原，荧光标记羊抗兔的制备，在甘油，吐温等保护剂下，实现信号的增强放大，从而达到对甘胆酸含量的检测。本发明的检测甘胆酸的免疫分析方法为一步法竞争荧光增强免疫分析方法，是一种简便、快速且能够高通量的检测方法。

主权项

1.一种非诊断目的的检测甘胆酸的荧光增强免疫分析方法，其特征在于包括以下操作步骤：(1)取甘胆酸完全抗原，用碳酸盐缓冲液进行稀释，将稀释后的甘胆酸完全抗原包被至固相载体表面，4℃包被过夜，随后用洗涤缓冲液洗涤所述固相载体并甩干，得到包被有甘胆酸完全抗原的固相载体；(2)随后加入封闭缓冲液封闭步骤(1)获得的包被有甘胆酸完全抗原的固相载体表面的空余间隙，37℃封闭过夜，随后用洗涤缓冲液洗涤固相载体并甩干；(3)取抗甘胆酸多克隆抗体50μL，与等体积的浓度梯度为0.00μg/mL、0.02μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、10.00μg/mL、20.00μg/mL、100μg/mL的甘胆酸标准溶液混合，37℃下孵育30分钟，加入步骤(2)获得的固相载体上包被的甘胆酸完全抗原反应连接，在37℃条件下进行反应，随后用洗涤缓冲液洗涤固相载体并甩干；(4)随后加入荧光标记的羊抗兔100μL，与步骤(3)获得的固相载体表面反应连接后，加入荧光稳定剂100μL，进行信号放大检测；以抑制率F‑F₀/F_max为纵坐标，甘胆酸浓度为横坐标作标准曲线，其IC₅₀为4.48μg/mL，线性方程为：线性范围为0.1‑20μg/mL，最低检测线为0.09μg/mL；所述荧光标记的羊抗兔是将羊抗兔和荧光素反应并透析完全获得，具体按照以下步骤进行制备：将羊抗兔溶于PBS，随后加入荧光素溶液，羊抗兔和荧光素的摩尔比例为1:10‑1:500，4℃下搅拌过夜；将反应液装入透析袋中透析三天，每隔12小时换液一次，得到荧光标记的羊抗兔；所述荧光稳定剂为甘油或者吐温20。