[发明专利]一种高效快速适配体筛选方法

摘要

本发明提供一种高效快速筛选适配体的方法，以髓系分化抗原CD33位靶标，在筛选时先进行六轮阴性筛选去除非特异性结合，再进行阳性筛选，筛选出能够特异性结合髓系分化抗原CD33蛋白的核酸适配体。并且通过流式细胞术验证了筛选出的适配体具有特异性以及高亲和性。本发明发明方法设计合理，采用293T细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选，最终快速高效地筛选出具有特异性的核酸适配体。

主权项

1.一种高效快速筛选适配体的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：将HEK‑293T细胞种于六孔板汇总，待六孔板中HEK‑293T细胞生长至90%，将第一个孔上层培养基吸出，用洗涤缓冲液洗涤两次；再加入预处理过的ssDNA文库，置于4℃冰箱内的水平摇床上，4℃、15rpm孵育30min，然后，将ssDNA文库从上一个孔吸出，加入预先洗涤两次的第二个孔中，4℃、15rpm孵育30min，重复以上方法，直至阴性筛选六轮后，吸出待用；将HEK‑293T细胞瞬转质粒，48h后作为阳性细胞，用洗涤缓冲液洗涤细胞两次；将阴性筛选六轮后的ssDNA文库缓慢加入阳性细胞中，4℃、15rpm孵育30min，孵育完毕后，用洗涤缓冲液，缓慢洗涤细胞三次，再加入无DNA酶水500μl，用细胞刮刀将细胞收集入1.5ml离心管中，95℃加热10min重悬ssDNA，再13000g离心5min收集筛选后的ssDNA文库，将第一轮筛选得到的ssDNA文库进行PCR扩增、酶切纯化后，干燥用做下一轮筛选文库，循环至筛选结束，筛选出具有特异性的核酸适配体；所述洗涤缓冲液由4.5g Glucose，1nM MgCl2 5ml，用DPBS溶解并定容至1L；采用293T 细胞作为筛选的阴性细胞，转染CD33质粒的293T细胞作为阳性细胞进行适配体的筛选。