[发明专利]一种碘泡虫的细胞培养方法

摘要

一种碘泡虫的细胞培养方法，属于寄生虫体外培养技术领域，包括四个步骤，原代细胞的培养、传代细胞培养、碘泡虫的细胞培养以及计数及绘制生长曲线，其中原代细胞的培养包括鲫鱼鳍条原代细胞培养和鲫鱼肌肉原代细胞培养，传代细胞培养包括细胞培养、冻存细胞以及复苏细胞，碘泡虫的细胞培养包括制备碘泡虫悬液和碘泡虫的培养。本发明对其培养条件进行优化，使碘泡虫在鱼体寄主之外的一个适宜环境中得以繁殖，为之后的药效学或疫苗等深入研究提供大量的基础材料，并促进碘泡虫引发的疾病或粘孢子虫病的进一步研究。

主权项

一种碘泡虫的细胞培养方法，其特征是：包括以下步骤，步骤一、原代细胞的培养鲫鱼鳍条原代细胞培养采用组织块培养法，选取6cm～7cm的鲫鱼，消毒后剪取尾鳍组织，置于超净台内，用无菌的AIM培养液处理，并刮除尾鳍粘液，用剪刀将组织剪碎，组织块大小为0.9mm³～1.1mm³，均匀摆放在细胞培养瓶内，加入培养液，放入恒温培养箱，启动原代培养，原代细胞培养3天～5天后，组织块周围有单层细胞迁出；鲫鱼肌肉原代细胞培养选取6cm～7cm的鲫鱼，消毒后置于超净台内，去除鱼体表皮，剪取鱼体背部肌肉，取无菌的AIM培养液进行处理，用剪刀将组织剪碎，组织块大小为0.9mm³～1.1mm³，等间距摆放在细胞培养瓶内，加入培养液，放入恒温培养箱，启动原代培养，原代细胞培养8天～10天后，组织块周围有单层细胞迁出；步骤二、传代细胞培养待细胞长满至细胞培养瓶底部78％～85％时，采用1ml胰酶消化液消化，消化液将瓶底大部分浸润，消化1min，细胞呈沙粒状从细胞培养瓶底部开始脱落，加入细胞培养液终止消化，将细胞悬液转移到离心管内，1000rpm/min离心8min,弃去管内上清液，加入10ml配制好的细胞培养液，吹打混合，吸取5ml的细胞悬液传到下一个细胞培养瓶中；在相同的培养条件下培养细胞，至其长满瓶底部；冻存细胞挑选处于对数生长期的细胞进行冻存；首先配制冻存液，用1mL的细胞消化液将细胞消化掉后，加入细胞培养液终止消化，转移到离心管内，1000rpm/min离心8min，弃去上清液，将冻存液细胞混合，分装到冻存管内，将细胞种类、冻存日期标记清楚，依次放置在4℃的冰箱内1h；‑20℃的冰箱内30min；‑80℃的冰箱内12h～15h后取出，放入液氮罐中存放，备用；复苏细胞将冻存在液氮罐的细胞取出，用镊子夹取冻存管置于30℃的水浴中，至管内液体完全融化，用75％的酒精对冻存管外部进行消毒，放入超净台内，用移液枪将解冻的细胞悬液转移至已配好的含20％胎牛血清的L‑15液体培养液内，置于26℃、CO₂浓度为5％的细胞培养箱内，培养12h，在倒置显微镜下观察细胞贴壁达到60％～80％，更换新的培养液继续培养；步骤三、碘泡虫的细胞培养制备碘泡虫悬液取碘泡虫的孢囊放入2ml的离心管中，加入1ml超纯水；用移液枪的枪头混合，在1000rpm的条件下，离心处理8min；去掉上清液，向离心管中加1mlPBS磷酸缓冲盐溶液混合，在1000rpm的条件下，离心处理8min；去掉上清液，向离心管中加2mlAIM培养液，与沉淀在离心管底部的碘泡虫混合，取下一个2ml离心管将混合液平分至每管各有1ml含碘泡虫的AIM培养液，在1000rpm的条件下，离心处理8min；去掉上清液，将两个2ml离心管中的碘泡虫分别移至两个10ml的离心管中备用，其中，一个离心管中有5ml的L‑15培养液，另一个离心管有M199培养液；碘泡虫的培养选取四瓶长至80％单层细胞的细胞培养瓶，每瓶中分别加入含有10％血清和1％双抗的4ml L‑15培养液或M199培养液，以及1ml的碘泡虫悬液，在26℃的温度条件下进行培养；步骤四、计数及绘制生长曲线在所述步骤三的连续培养过程中，每隔72小时进行一次计数，共计数7次，取第一次为基础数据，计数时将培养瓶中所培养的碘泡虫混合，并从每一瓶中分别吸取10μL的碘泡虫，用细胞计数板进行计数；根据记录的数据绘制生长曲线。