[发明专利]重组鲎三因子试剂及其检测内毒素的方法

摘要

本发明公开了一种重组鲎三因子试剂，其包含如下组分：无内毒素水；无热源Tris缓冲液；吐温‑20；荧光底物；重组鲎C因子；重组鲎B因子；重组鲎凝固酶原因子。本发明提供一种重组鲎三因子试剂及其检测内毒素方法，通过利用昆虫杆状病毒表达系统表达出重组鲎三因子(凝固酶原、B和C因子)，用于检测细菌内毒素，此方法排除了G因子旁路干扰，从而有效地避免了葡聚糖产生假阳性的可能性，并且解决了鲎数量有限、鲎试剂各批次不稳定性的缺点，可作为新型内毒素检测试剂。

主权项

1.一种重组鲎三因子试剂，其特征在于，其包含如下组分：无内毒素水；无热源Tris缓冲液；吐温‑20；荧光底物；重组鲎C因子；重组鲎B因子；重组鲎凝固酶原因子；所述重组鲎C因子、重组鲎B因子以及重组鲎凝固酶原因子具体采用如下方法获得：步骤1)提取鲎血液中总的RNA，通过反转录与PCR技术对鲎C因子、鲎B因子以及鲎凝固酶原因子分别进行扩增，分别得到PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增的鲎凝固酶原因子基因片段；步骤2)提供pTA2载体，分别将PCR扩增的鲎C因子，PCR扩增的鲎B因子以及PCR扩增的鲎凝固酶原因子的基因片段连接到所述pTA2载体上，分别得到第一重组质粒；对所述每种第一重组质粒依次经过筛选、抽提、鉴定和双酶切，分别得到第一产物；步骤3)将通过双酶切获得的鲎C因子或鲎凝固酶原因子基因片段得到的第一产物与pFastBac‑Dual载体连接，将通过双酶切获得的鲎B因子基因片段第一产物与pFastBac1载体连接，分别得到两种第二重组质粒；步骤4)分别将所述每种第二重组质粒转化感受态细胞DH10Bac，并依次经过筛选、抽提和鉴定，分别得到bacmid重组杆粒；步骤5)将得到的每种bacmid重组杆粒转染昆虫细胞，采用昆虫细胞培养基培养，得到重组杆状病毒，将首次得到的重组杆状病毒以MOI为0.1的病毒感染量感染昆虫细胞，通过4次感染，分别得到重组鲎C因子、重组鲎B因子和重组鲎凝固酶原因子；所述步骤5)中，采用的所述昆虫细胞培养基经过超滤处理。