[发明专利]用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法

摘要

本发明涉及骨性关节炎治疗领域，尤其是一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，第一步，微囊化脂肪间充质干细胞的制备；第二步，制备动物来源的软骨细胞与滑膜细胞；第三步，对脂肪间充质干细胞的炎症性诱导；第四步，脂肪间充质干细胞的处理。本发明所得到的用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，在体外利用骨性关节炎来源的细胞与脂肪间充质干细胞共培养，并发明了一种新的体外共培养体系，使得脂肪间充质干细胞在体外就可以获得针对骨性关节炎的治疗特性，移植体内后可显著提升对骨性关节炎的治疗效果。

主权项

一种用于治疗骨性关节炎的脂肪间充质干细胞制剂的制备方法，其特征是：第一步，微囊化脂肪间充质干细胞的制备：收集培养结束的3代‑10代的脂肪间充质干细胞，将脂肪间充质干细胞充分、均匀的混悬在海藻酸钠、羧甲基壳聚糖、聚乙二醇‑4000三种物质混合配制的溶液中，其中三种物质的浓度分别为1%～3%、1%～3%、4～10%，其基础溶剂为生理盐水，脂肪间充质干细胞悬浮在混合液中的终浓度控制在1×10⁵～1×10⁶，将含有脂肪间充质干细胞的混合液加入到微量注射器中，然后注射到含40～100mmol/L的CaCl₂的DMEM培养液中，控制出液的液珠球径不大于0.5mm，将含脂肪间充质干细胞的液珠在含CaCl₂的液体中静置30秒～1分钟形成凝胶微球，然后将凝胶微球转到DMEM培养基中待用；第二步，制备动物来源的软骨细胞与滑膜细胞：准备6～12月大的哺乳动物，利用生理盐水配制木瓜蛋白酶与胶原酶的混合酶液，木瓜蛋白酶的浓度为2%～6%，其中胶原酶采用II型胶原酶, II型胶原酶的浓度为1%～3%,将混合酶液每隔2～3天注射0.2～0.5mL到每只哺乳动物的髋关节中，一共注射3～6次，注射完成后的半个月到2个月后，打开髋关节，可见关节软骨有明显的变性时取出滑膜组织与软骨组织；第三步，对脂肪间充质干细胞的炎症性诱导：将滑膜组织与软骨组织取出后，利用无菌的平衡液清洗多遍，将滑膜组织和软骨组织剪切成体积较为1mm×1mm×1mm的小组织块，将组织块放入培养瓶中，倒入少量含10%胎牛血清的DMEM培养液，培养液略微覆盖组织块表面，在37℃、5%CO₂浓度、95%湿度条件下培养4～6小时，然后加入足量的α～MEM培养液，培养3～15天后，更换DMEM培养液并倒去未贴壁的细胞与组织块，同时将含间充质干细胞的凝胶微球加入到上述培养瓶中，与滑膜组织、软骨组织进行共培养，培养3～7天后，利用100～300目的筛网滤得含脂肪间充质干细胞的凝胶微球，利用无菌平衡溶液清洗凝胶微球5～10遍，其中共培养体系的培养液成分为：基础溶剂为DMEM，含10%胎牛血清，1～3ng/mL的白介素‑1，1～3ng/mL的白介素‑17，1～3ng/mL的肿瘤坏死因子；第四步，脂肪间充质干细胞的处理：将培养结束后的脂肪间充质干细胞的凝胶微球加入含0.05%～0.1%乙二胺四乙酸二钠、1%～5%柠檬酸三钠的DMEM培养液中，在37℃条件下温育1～3个小时，直至凝胶微球结构崩解，采用轻柔的方法将脂肪间充质干细胞充分的打散在液体中，直至不可见凝胶结构，然后用100～300目的筛网进行过滤，收集脂肪间充质干细胞的混悬液，然后离心收集脂肪间充质干细胞，利用无菌平衡溶液进行清洗3～6遍，使用前利用台盼蓝染色进行细胞活力的检测，脂肪间充质干细胞活率大于80%的条件下，将脂肪间充质干细胞与关节注射用透明质酸溶液进行充分混合后，至细胞浓度为5×10⁶～5×10⁷；该脂肪间充质干细胞混悬液即为脂肪间充质干细胞制剂。