[发明专利]承载GAD65 p271-284肽段的I-Ag7果蝇细胞高表达基因序列和构建的Tetramer

摘要

本发明提供了承载GAD65 p271‑284肽段的I‑Ag7果蝇细胞高表达基因序列，包含如SEQ NO.1所示的MHC II‑α‑Fos‑BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271‑284‑MHC II‑β‑Jun融合基因序列。还提供了承载GAD65 p271‑284肽段的I‑Ag7的Tetramer，将SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的序列分别克隆到表达载体中，再同时转染到果蝇细胞中表达，将得到的MHC II‑α‑Fos‑BSP和GAD65p271‑284‑MHC II‑β‑Jun融合蛋白形成异源二聚体生物素化，最后与荧光素标记的链霉亲和素结合，即形成承载GAD65 p271‑284肽段的I‑Ag7的Tetramer。本发明通过探讨种属偏好性表达，拟找到最佳的表达序列，最终提高重组蛋白的表达效率。

主权项

1.承载GAD65 p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，将SEQ NO.1和SEQ NO.3所示的序列分别克隆到表达载体中，再同时转染到果蝇细胞中表达，将得到的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β-Jun融合蛋白形成异源二聚体生物素化，最后与荧光素标记的链霉亲和素结合，即形成承载GAD65 p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer；/n所述的表达载体为pMT/BiP/V5-His；果蝇细胞为S2；/n具体构建过程如下：/n1）提取NOD鼠脾脏细胞的总RNA；/n2）反转录获得cDNA；/n3）引物和酶切位点设计/n根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点，采用PCR扩增MHC II-α链并加入EcoRI和SalI酶切位点，引物如下所示：/nforward primer：5’-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3’；/nreverse primer：5’-AAA AAAGTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3’；/n采用重叠PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位点进行克隆, 同时在EcoRI酶切位点之后加入SalI酶切位点，首先采用/nforward primer：/n5’-CAGAATAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3’；/nreverse primer：/n5’-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTT CGCGGA-3’；/n互为模板进行扩增，然后第二轮以第一轮产物为模板采用/nforward primer：/n5’-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAG CGAGCTT-3’；/nreverse primer：/n5’-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGA TCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA -3’；/n进行扩增；/n随后，第三轮以第二轮产物为模板采用/nforward primer：/n5’-GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA-3’；/nreverse primer：/n5’-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT-3’；/n最终获得带有EcoRI/Sal I和Not I酶切位点的Fos+BSP融合基因序列；/n根据NCBI数据库的序列设计引物，并加入酶切位点，采用PCR扩增MHC II-β链，加入EcoRI和SalI酶切位点，引物为：/nforward primer：5’-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3’；/nreverse primer：5’-AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA-3’；/n采用重叠PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位点进行克隆；首先采用，/nforward primer：/n5’-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA-3’；/nreverse primer：/n5’-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT -3’；/n互为模板进行扩增，然后第二轮以第一轮产物为模板采用，/nforward primer：/n5’-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG -3’；/nreverse primer：/n5’-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT- CAGGAGGTTT- GCAATCTCCGTCT-3’；/n进行扩增；随后，第三轮以第二轮产物为模板采用，/nforward primer：5’-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA- TTTGTGCTTTTGGAA- 3’；/nreverse primer：5’-GCG GCCGCGTGAGCGGCGA- GGATAAACTCGAGTTTC -3’，/n最终获得带有Sma I和Not I酶切位点的基因序列；/n4）PCR扩增获得目的片段；/n5）目的片段采用载体进行连接；/n6）将获得的基因序列进行密码子优化改造；/n7）转化到感受态细胞中，再进行质粒抽提；/n8）双酶切获得目标片段；/n9） 重组转化:将MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因分别克隆入表达载体；/n10）将得到的MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun融合基因双质粒转染果蝇细胞表达蛋白；/n11）步骤10）获得的蛋白经过纯化后用于制备承载GAD65 p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer；/n步骤5）中的载体为pmD18-t；/n步骤9）的具体过程如下：/n对于MHC II-α-Fos-BSP的克隆，先将Fos+BSP用EcoRI和NotI克隆入表达载体，然后用EcoRI和SalI将α链克隆入带有Fos+BSP融合基因的表达载体；对于GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun基因的克隆，要先用SmaI和NotI克隆GAD65 p271-284-Jun融合基因克隆进表达载体，然后把β链通过EcoRI和Sal I酶切位点插入GAD65 p271-284-Jun融合基因之间；/n利用连接酶进行重组连接：连接片段100 ng，加入100 ng pMT/BiP/V5-His质粒，10 μl10×反应buffer和1 μl连接酶，补足水到20μl；在16℃水浴中连接24h，并转化感受态细胞；/n步骤10）的具体过程：/nA.选取培养好的健康的S2细胞，将3×10⁶个细胞接种在60mm组织培养皿中，培养基为针对S2细胞的Schneider’s Drosophila Medium，每皿加入3ml的培养基，28℃无菌条件下在恒温培养箱中进行培养；/nB. 使用Life technology公司提供的磷酸钙转染试剂盒K2780-01进行细胞转染；/na) 对于每个转染反应，采用一个无菌的1.5ml的离心管，依次加入双蒸水236μl，氯化钙240 mM 36μl，1 μg/μlα链质粒 9 μl，1 μg/μlβ链质粒9 μl；/nb) 缓慢的将这些混合物混合1min后转移到一个含有200μl的2 × HEPES HBS的离心管，然后混匀；该过程使质粒DNA逐渐进入细胞中；/nc) 将混合物在室温放置30-40min；/nd) 缓慢将混合物加入到细胞培养基中，缓慢旋转培养皿以充分混匀；/ne) 在28℃的恒温培养箱中培养1天；/nf) 给细胞的培养基进行换液；/ni) 将培养基连同细胞一起吸入15ml的离心管中；/nii) 3000r/min离心3min，后去除上清，并加入1 ml新鲜培养基到15ml的离心/n管中；/niii) 将混合物重新加入到新的离心管中；/niv) 用2ml培养基重新清洗一次；/nv) 用2ml培养基悬浮细胞，并转到培养皿中培养；/ng) 28℃培养两天；/n步骤10）转染后的细胞培养在含2 mg/ml G418、10%胎牛血清的SFM培养基中，分为10个T225细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目长到4 x 10⁶ cells/ml时准备诱导；准备诱导时，将10个细胞培养瓶分为20个细胞培养瓶，每瓶100ml培养基，细胞数目为2 x 10⁶ cells/ml；培养基换成含1%胎牛血清的SFM培养基；加入终浓度500mM的 CuSO₄诱导MHC II-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC II-β链-Jun形成的异源二聚体的表达，4天后收集5L细胞上清;将细胞培养物上清液通过切向流超滤浓缩后，再通过镍离子亲和纯化色谱靶向获得。/n