[发明专利]一种双重复合免疫捕获RT-PCR反应同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法

摘要

本发明提供了一种免疫捕获双重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒和百合斑驳病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV和LMoV的多克隆抗体特异性捕获LSV和LMoV粒子、利用LSV和LMoV的特异性引物进行双重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测两种百合病毒LSV和LMoV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。

主权项

一种同步检测百合隐症病毒和斑驳病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：①LSV和LMoV的多克隆抗体被包被在同一个PCR反应管中，捕获LSV和LMoV粒子，具体是用pH9.6的碳酸盐缓冲液将兔抗LMoV和LSV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV和LSV两种抗体的终浓度分别为1μg/mL和10μg/mL，取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管；②捕获的LSV和LMoV粒子作为模板，利用LSV 和LMoV 的特异性反向引物LSV‑R和LMoV‑R以及M‑MLV反转录酶进行双重RT，合成LSV和LMoV 两种病毒的cDNAs第一链混合物；③利用②获得的cDNAs为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下进行双重PCR；④采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤③获得的双重PCR反应产物，LSV和LMoV两种病毒核酸片段的电泳条带分别出现在198bp和395bp处;⑤根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV或LMoV，若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV；若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV；若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV。