[发明专利]一种利用甘蔗花叶病毒P3N-PIPO构建的亚细胞定位试剂盒

摘要

本发明涉及一种利用甘蔗花叶病毒P3N‑PIPO构建的植物亚细胞定位试剂盒，包括4个分别标记绿色、红色、黄色和青色荧光蛋白的胞间连丝定位载体：SCMV‑P3N‑PIPO‑GFP、pSCMV‑P3N‑PIPO‑RFP、pSCMV‑P3N‑PIPO‑YFP和pSCMV‑P3N‑PIPO‑CFP；4个无特异亚细胞定位的对照载体：pSAT6‑EGFP‑C1、pSAT6‑ERFP‑C1、pSAT6‑EYFP‑C1和pSAT6‑ECFP‑C1；限制性内切酶Xho I、Hind III、无RNase水和侵染液。使用本试剂盒可以快速明确目的基因表达产物是否具有胞间连丝定位的特性。

主权项

1.一种荧光蛋白标记的PD定位载体的制备方法，其特征在于：(1)针对SCMV-P3的编码序列设计特异PCR引物SCMV-P3-F和SCMV-P3-R，以SCMV的cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得SCMV-P3的编码序列；所述SCMV-P3-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；SCMV-P3-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；SCMV-P3编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列；(2)设计特异PCR引物SCMV-P3N-F和SCMV-P3N-R，在SCMV-P3N-F中引入酶切位点Xho I；以SCMV-P3编码序列为模板，使用引物SCMV-P3N-F和SCMV-P3N-R进行PCR扩增，PCR反应结束后，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并浓缩至400ng/μL，获得SCMV-P3N的编码序列；所述SCMV-P3N-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；SCMV-P3N-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；SCMV-P3N编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；(3)SCMV-PIPO编码序列的获得：设计特异PCR引物SCMV-PIPO-F和SCMV-PIPO-R，在SCMV-PIPO-R中引入酶切位点Hind III；以SCMV-P3编码序列为模板，使用引物SCMV-PIPO-F和SCMV-PIPO-R进行PCR扩增，PCR反应结束后，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收并浓缩至400ng/μL，获得SCMV-PIPO的编码序列；所述SCMV-PIPO-F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；SCMV-PIPO-R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；SCMV-PIPO编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；(4)SCMV-P3N-PIPO编码序列的获得：将浓度均为400ng/μL的P3N和PIPO的PCR产物按照1︰1混合作为模板，使用引物SCMV-P3N-F和SCMV-PIPO-R，利用融合PCR方法克隆SCMV-P3NPIPO编码序列；PCR反应结束后，将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得SCMV-P3N-PIPO的编码序列；所述SCMV-P3N-PIPO编码序列的核苷酸序列为序列表中SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列；(5)插入片段S的获得：使用Xho I和Hind III对SCMV-P3N-PIPO编码序列进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收，获得插入片段S；所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列；(6)荧光蛋白标记的PD定位载体的获得：使用Xho I和Hind III分别对载体pSAT6-EGFP-C1、pSAT6-ERFP-C1、pSAT6-EYFP-C1和pSAT6-ECFP-C1进行双酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离并回收；然后用T4DNA连接酶将酶切产物与插入片段S连接，并将连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆验证，分别获得的荧光蛋白标记PD定位载体pSCMV-P3N-PIPO-GFP、pSCMV-P3N-PIPO-RFP、pSCMV-P3N-PIPO-YFP、pSCMV-P3N-PIPO-CFP；所述插入片段S的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。