[发明专利]利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法

摘要

本发明涉及一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法，包括RNAi载体构建、遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定。本发明采用融合PCR技术，克隆了SCMV的P3N‑PIPO的编码序列，以pGBKT7‑SCMV‑P3NPIPO为诱饵从甘蔗的酵母文库中筛选到了与P3N‑PIPO互作的甘蔗基因ScPCaP。以ScPCaP作为RNAi干扰靶序列，经遗传转化后获得了对SCMV，SrMV和SCSMV均有抗性的转基因甘蔗植株，并具有抗性广谱、抗病性好、抗性持久的特点，有效缩短了甘蔗抗花叶病育种周期。采用本发明的利用RNAi阻断病毒胞间移动的方法培育抗花叶病转基因甘蔗，在转基因生物安全上，优于转入病毒序列的转基因甘蔗。

主权项

1.一种利用RNAi阻断病毒胞间移动培育抗花叶病转基因甘蔗的方法，包括RNAi载体构建、遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定，其特征在于：(1)RNAi载体构建：A、以ScPCaP基因的3′端为靶位区段，设计的一对特异性引物ScPCaP‑F和ScPCaP‑R，上游引物ScPCaP‑F含有Xba I和Xho I酶切位点，下游引物ScPCaP‑R含有HindⅢ和Kpn I酶切位点，通过PCR反应，获得5′端带有Xba I和Xho I酶切位点，3′带有HindⅢ和Kpn I酶切位点的PCR产物，将PCR产物连接到pMD19‑T载体中，获得含有ScPCaP基因的载体pMD19‑T‑PCaP；所述ScPCaP基因的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列；上游引物ScPCaP‑F的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；下游引物ScPCaP‑R的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；B、用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切载体pMD19‑T‑PCaP回收正向片段S1，S1的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列；用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切pHANNIBAL载体，用T4DNA连接酶将正向片段S1连接到pHANNIBAL载体上，得到重组质粒pS1；用XbaⅠ和HindⅢ双酶切载体pMD19‑T‑PCaP，并回收反向互补片段S2，S2的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；用XbaⅠ和HindⅢ双酶切载体pS1，用T4DNA连接酶将反向互补片段S2连接到重组质粒pS1上，得到以pHANNIBAL载体内含子intron作为间隔区、具有发卡结构反向重复序列的中间载体pS1S2，然后用NotⅠ单酶切中间载体pS1S2，并回收S1‑intron‑S2片段；用NotⅠ单酶切pGREEN载体，将S1‑intron‑S2片段用T4DNA连接酶连接到pGREEN载体上，得到RNAi干扰载体pG0229‑PCaP；(2)遗传转化、转基因甘蔗植株的筛选鉴定及对花叶病的抗性鉴定：提取构建完成的RNAi干扰载体pG0229‑PCaP质粒DNA，用核酸蛋白测定仪测定其浓度和纯度，并将其定量至1μg/μL，基因枪轰击法转化甘蔗，筛选鉴定阳性转基因植株，并接种SCMV、SrMV、SCSMV对转基因甘蔗植株进行抗性鉴定。