[发明专利]一种基于电还原氧化石墨烯和纳米金修饰电极的DNA传感器的制备及应用方法

摘要

本发明公开了一种利用电化学方法制备纳米金和部分还原氧化石墨烯(p‑RGO)修饰的离子液体碳糊电极(CILE)，以此为平台构建了一种新的电化学DNA传感器，并将其成功应用于李斯特氏菌特征基因序列检测的方法。使用1‑己基吡啶六氟磷酸盐作为修饰剂制得基体电极CILE，在表面电沉积纳米金颗粒后通过控制电化学还原条件来制备p‑RGO，利用p‑RGO表面剩余的羧基，将氨基修饰的探针ssDNA通过酰胺键共价键合法固定在电极表面构成ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE。与目标序列杂交后以亚甲基蓝(MB)为指示剂来检测杂交反应的进行，使用差分脉冲伏安法(DPV)对李斯特氏菌特征基因片段进行了检测。

主权项

1.一种基于电化学还原部分氧化石墨烯和金纳米颗粒复合修饰电极的电化学DNA传感器测试李斯特氏菌特征基因片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐以2：1的质量比混合研磨均匀得到离子液体修饰碳糊，然后将离子液体修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，可得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)；(2)将氯金酸和硝酸钠以一定比例混合制备电解液，CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗粒，用蒸馏水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥备用；(3)在AuNPs/CILE电极上滴涂一定浓度氧化石墨烯(GO)分散液，自然晾干后得到GO修饰的电极(GO/AuNPs/CILE)，然后在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中恒电位还原，一定时间后取出电极用二次蒸馏水充分冲洗，N2吹干得到p‑RGO/AuNPs/CILE；(4)将p‑RGO/AuNPs/CILE浸入含乙基(3‑二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N‑羟基琥珀酰亚胺(NHS)的PBS中，以活化修饰电极表面的羧基，然后在电极表面均匀滴涂含有氨基修饰的探针ssDNA序列的缓冲溶液，修饰有氨基的探针序列可以和电极表面的羧基发生共价键合反应形成酰胺键进而固定ssDNA形成一层稳定的探针，自然晾干后分别使用0.5％的十二烷基磺酸钠溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针序列，即可得到固定有探针序列的电极ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE；(5)将含有目标序列的PBS直接滴涂在ssDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE表面，在室温下杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，杂交后的电极记为dsDNA/p‑RGO/AuNPs/CILE；(6)将杂交后的电极浸入亚甲基蓝(MB)溶液中吸附一定时间，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，使用示差脉冲伏安法测定MB在Tris‑HCl缓冲溶液中的电化学行为，循环伏安在1.0mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5mol/L KCl混合溶液中进行，扫速100mV/s；电化学交流阻抗在10.0mmol/L[Fe(CN)6]3‑/4‑和0.1mol/L KCl混合溶液中进行，频率范围104～0.1Hz；步骤(1)中所述研磨的时间为1.5h～3h；所述玻璃电极管的内径为3mm～5mm，两端用砂纸80#～1200#打磨光滑；步骤(2)中所述的混合制备电解液中氯金酸的浓度为3.0mmol/L，硝酸钠的浓度为0.1mol/L；所述恒电位沉积法的沉积电位为‑0.2V(vs.SCE)，沉积时间为30s；步骤(3)中所述的氧化石墨烯分散液的浓度为1.0mg/mL，滴涂量为10.0μL，PBS浓度为0.2mol/L，pH为8.0，恒电位还原的电位为‑1.3V，时间为150s；步骤(4)中所述的PBS溶液含EDC浓度为5.0mmol/L和NHS浓度为8.0mmol/L，浸入时间为30min，在电极表面滴涂的含有1.0×10‑6mol/L氨基修饰的探针ssDNA序列的PBS缓冲溶液，pH为7.0，滴涂量为10.0μL；所述探针序列为：5'‑NH2‑TGG CGG CAC ATT TGT CAC TGCA‑3'；步骤(5)中所述的含有目标ssDNA序列的PBS的浓度为50.0mmol/L，pH为7.0，滴涂量为10.0μL；所述目标序列为：5'‑TGCAGT GACAAATGT GCC GCCA‑3'；步骤(6)中所述MB溶液的浓度为2.0×10‑5mol/L，吸附时间为8min，含有MB的Tris‑HCl缓冲溶液的pH为7.0，浓度为50.0mmol/L，示差脉冲伏安法测定仪器条件为电位增量0.008V，脉冲宽度0.05s，脉冲周期0.2s。