[发明专利]一种实现人源精氨酸酶-1在大肠杆菌表面展示的方法

摘要

本发明提出了一种实现人源精氨酸酶‑1在大肠杆菌表面展示的方法。步骤为：1)构建人源精氨酸酶‑1表面展示重组质粒；2)将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞，获得基因工程菌株；3)将重组菌株摇瓶培养，检测人源精氨酸酶‑1展示效率和酶活；4)利用重组菌株高效转化L‑Arginine(L‑精氨酸，L‑Arg)合成L‑Ornithine(L‑鸟氨酸，L‑Orn)。本发明通过改进的Type V自转运蛋白(Antigen 43)实现人源精氨酸酶‑1在大肠杆菌细胞表面有效展示，加速实现了人源精氨酸酶‑1工业化应用。与原始的Type V自转运蛋白(Antigen 43)展示系统相比，明显提高人源精氨酸酶‑1展示效率和酶活，与现有几丁质固定化法相比，降低合成成本，缩短工艺流程，简化纯化步骤。

主权项

一种实现人源精氨酸酶‑1在大肠杆菌表面展示的方法，其特征在于：1)首先，设计构建重组质粒pET23a/H₆ARG1‑Ag43；其次，设计PCR引物携带编码带电荷多肽6×Lys和6×Asp的序列，通过PCR替换重组质粒pET23a/H₆ARG1‑Ag43上的Ag43蛋白的原始信号肽，构建重组表达质粒pET23a/H₆K₆‑ARG1‑Ag43和pET23a/H₆D₆‑ARG1‑Ag43；2)将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，37℃静置培养过夜，获得基因工程菌株；3)将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，离心收集菌株，此菌株经荧光抗体标记后，用流氏细胞术分析原始信号肽和带电荷多肽对Ag43蛋白展示人源精氨酸酶‑1的效率；用Chinard反应检测L‑Ornithine含量，进而原始信号肽和带电荷多肽对Ag43蛋白展示人源精氨酸酶‑1催化转化L‑Arg合成L‑Orn酶活的影响；4)经过测量后，选出转化L‑Arg合成L‑Orn的酶活高的基因工程菌株，在大规模培养，菌体经收集，洗涤去掉残存的培养基成分，重悬于碳酸氢盐缓冲液，以L‑Arg作为底物，转化合成L‑Orn。