[发明专利]构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法及其应用在审
| 申请号： | 201610222505.1 | 申请日： | 2016-04-11 |
| 公开（公告）号： | CN107287228A | 公开（公告）日： | 2017-10-24 |
| 发明（设计）人： | 李一凡;许静;张丽华;柳振宇 | 申请（专利权）人： | 南京金斯瑞生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/65 | 分类号： | C12N15/65;C12N15/10;C12N15/75;C12R1/125 |
| 代理公司： | 南京天华专利代理有限责任公司32218 | 代理人： | 夏平,李晓峰 |
| 地址： | 211100 江苏省南京*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | 本发明公开一种构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法及其应用，包括以下步骤(1)将毒性基因从中间分成两部分前半部分毒性基因和后半部分毒性基因，并分别克隆入克隆载体；(2)将上下游同源臂分别克隆入克隆载体；(3)将步骤(1)制备的载体质粒和步骤(2)制备的载体质粒混合在一起，利用金门组装反应将两部分毒性基因片段和上下游同源臂共四个片段拼接在一起；(4)将拼接产物做为PCR模板，扩增基因组编辑正负筛选标记模板的全长。本发明方法仅需要一个金门组装反应和一个PCR反应就可以扩增出可以直接转化的正负筛选标记模板。避免了克隆毒性基因的困难和多重PCR过程引入的突变和造成的不便。 | ||
| 搜索关键词： | 构建 基因组 编辑 正负 筛选 标记 模板 方法 及其 应用 | ||
【主权项】：
一种构建基因组编辑正负筛选标记模板的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)将毒性基因从中间分成两部分，然后将前半部分毒性基因和后半部分毒性基因分别克隆入克隆载体，并将前半部分毒性基因与一个正筛选标记相结合，两部分毒性基因均加入了限制性内切酶位点和相匹配的粘性末端；(2)将上下游同源臂分别克隆入克隆载体，并且在上同源臂的下游和下同源臂的上游加正向重复片段、限制性内切酶位点和相匹配的粘性末端；(3)将步骤(1)制备的含有前半部分毒性基因的载体质粒、含有后半部分毒性基因的载体质粒和步骤(2)制备的分别含有上下游同源臂的载体质粒混合在一起，利用金门组装反应将两部分毒性基因片段和上下游同源臂共四个片段拼接在一起；(4)将拼接产物做为PCR模板，扩增基因组编辑正负筛选标记模板的全长。
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