[发明专利]分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法

摘要

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法。本发明以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5’半长的重组质粒pA‑F123和含有BVDV VEDEVAC株Erns基因的重组质粒pE‑B‑Erns为模板，在两端设计20bp同源片段，使用一步定向克隆试剂盒，获得重组pA‑B‑Erns‑F123质粒；用BamH I和Sal I将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3’半长的F456片段从重组质粒pB‑F456中切下，克隆于相同酶作用的pA‑B‑Erns‑F123中，获得重组质粒pA‑B‑Erns‑FL。本发明的反向遗传操作技术的建立为研究CSFV基因功能和新型疫苗开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源标签插入病毒基因组可以用来研究病毒的复制、病毒编码蛋白的功能及抗病毒药物的筛选，使用RNA聚合酶Ⅱ系统能够高效和稳定地拯救猪瘟病毒感染性cDNA克隆。

主权项

1.一种分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)扩增牛病毒性腹泻病毒中Erns基因编码区的片段；(2)利用步骤(1)的序列，在其上下游分别引入猪瘟病毒疫苗C株CORE基因3’端和E1基因5’端的20个碱基同源序列片段，分别为：TGTACCAACCAGTTGAAGCC和CTATCGCCTTACTGTAATGT；(3)以含有猪瘟病毒疫苗C株基因组5＇半长的重组质粒pA‑F123为模板，扩增猪瘟病毒中Erns基因编码区以外的基因片段；(4)利用一步定向克隆将步骤(1)和(2)所获得的片段连接到步骤(3)所得质粒，获得携带有BVDV Erns的C株基因组5＇半长的重组pA‑B‑Erns‑F123质粒；(5)将含有猪瘟病毒疫苗C株基因组3＇半长的F456片段从重组质粒pB‑F456中切下，克隆于相同酶作用的步骤(4)所得质粒中，获得重组质粒pA‑B‑Erns‑FL；(6)将步骤(5)中获得的重组全长感染性克隆质粒体外转录为RNA，电转至宿主细胞，收获具有感染性的子代病毒粒子并命名为RecC‑B‑Erns，该子代病毒粒子即为分子标记猪瘟病毒弱毒疫苗。