[发明专利]一种昆虫成虫石蜡切片染色方法

摘要

一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，属于显微组织切片技术领域，包括组织固定、组织脱水、组织透明、浸蜡、包埋与切片、展片与烘片、脱蜡和组织复水、染色、脱水与透明、封片和观察，最终切片对组织区分度高，能够清晰观察到虫体内各个器官及组织的空间结构，适用于体壁坚硬、体腔液体含量较少的成虫虫体材料。采用该方法处理蚤蝇成虫虫体，在显微镜下可以清晰地观察到内部消化系统、排泄系统、神经系统、呼吸系统、循环系统及生殖系统。本发明昆虫成虫整体石蜡切片方法不仅可以填补昆虫成虫内部器官及组织观察的空白，还可以弥补局部观察的不足，为昆虫系统发育分析提供分类特征，操作简单，耗时短，成本低。

主权项

1.一种昆虫成虫石蜡切片染色方法，其特征在于，所述方法包括以下过程：(1) 组织固定：取去除足和翅的昆虫虫体浸于组织固定液中，室温下静置1小时，再于4℃下静置12小时；组织固定液为：浓度为0.5%的TritonX‑100‑4%多聚甲醛混合固定液；保存温度为零下20℃，用量与虫体体积比为50:1；（2）组织脱水：将经过（1）处理后的虫体取出，在4℃条件下，蒸馏水进行漂洗，再于室温下依次用浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液脱水，每个梯度的处理时间为20分钟；蒸馏水与乙醇用量与虫体的体积比为50:1；（3）组织透明：将经过（2）处理后的虫体取出，室温下依次在二甲苯：乙醇1:3混合液、二甲苯：乙醇1:1混合液中浸泡10分钟，再在纯二甲苯溶液中浸泡5分钟；（4）浸蜡、包埋与切片；将经过（3）处理后的虫体取出，在55℃的液体石蜡：二甲苯1:1混合液中浸泡2小时，再于60℃的液体石蜡中浸泡4小时，经过冷却、凝固、定形后取出，进行切片；（5）展片与烘片：取切片移至涂抹过粘片剂并预热至55℃的载玻片上，切片立即自然完全舒展，再置于37℃条件下12小时烘片；粘片剂的组成为：蛋白液、甘油、水杨酸钠；其比例为10:10:1；（6）脱蜡和组织复水：取烘片后的载玻片浸泡在二甲苯溶液中，保持5分钟，再依次浸泡浓度梯度为100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液，再浸泡于蒸馏水中，每个梯度的处理时间为1~3分钟；（7）染色：取组织复水后的载玻片浸泡在苏木精溶液中，保持5分钟，移至蒸馏水中漂洗1分钟，再移至返蓝液浸泡1分钟，再于分化液中30秒，最后于伊红溶液中染色2分钟；（8）脱水与透明：取染色后的载玻片进行蒸馏水漂洗5分钟，再依次浸泡在浓度梯度为70%、80%、90%、95%、100%的乙醇溶液中2~5分钟，移至二甲苯溶液中浸泡3分钟；（9）封片和观察在切片组织上滴加中性树胶，盖上盖玻片，置于通风橱中进行晾干后，在显微镜下观察。