[发明专利]一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻的方法

摘要

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法,该方法包括步骤如下：（1）获取绵羊卵巢；（2）捡出卵母细胞；（3）加入装有体外受精液的液滴内，备用；（4）将解冻后的冻精加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞孵育；（5）取出早期胚胎培养，统计囊胚率；（6）囊胚在添加ApAFP的冷冻液VS1和VS2中处理，最后装管液氮保存即可。通过这种方法能显著提高绵羊冷冻胚胎解冻后的存活率。

主权项

一种利用重组光滑鳖甲抗冻蛋白对绵羊体外胚胎进行冷冻保护的方法，其特征在于：该方法包括步骤如下：（1）获取宰杀后30分钟以内的绵羊卵巢，置入温度在30‑35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中，3小时内用生理盐水清洗3‑4次；（2）然后，用吸有2ml抽卵液的注射器抽吸卵巢表面2‑5mm大小的卵泡，将注射器内回收的卵泡液置于器皿中，在显微镜下捡出卵母细胞，用体外成熟液洗涤3‑5次，备用；（3）将步骤（2）中捡出的卵母细胞，在条件为5% CO₂，95%空气，温度为38.6℃的CO₂培养箱内培养22‑24小时，用绵羊体外受精液洗涤2‑4次，按25‑30枚/滴的密度加入装有体外受精液的液滴内，备用；（4）将解冻后的冻精，加入装有体外受精液的试管底部，CO₂培养箱内上游20‑25分钟，取上层精子混悬液，以1500转/分钟的转速离心4‑5分钟，然后弃去上清液，用剩余的精子沉淀进行密度计算，按2‑4×10⁶个/ml的密度加入步骤（3）的体外受精液滴中与卵母细胞共同孵育；（5）将步骤（4）中受精20‑22小时的早期胚胎取出，移至体外培养液IVC内洗涤3‑4次，并再次培养24‑26小时，将未卵裂卵母细胞剔除，统计卵裂率，并继续培养，144‑168小时后统计囊胚率；（6）将步骤（5）中获得的囊胚用冷冻基础液洗涤3遍，在添加ApAFP的冷冻液VS1中平衡5分钟，在添加ApAFP 914的冷冻液VS2中处理30秒，装管进行液氮保存即可。