[发明专利]一种巴豆醛‑DNA加合物的测定方法

摘要

一种巴豆醛‑DNA加合物的测定方法，即DNA中Propano‑dG的测定方法，采用巴豆醛溶液暴露小牛胸腺DNA，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标和DNA水解酶。水解液经Strata‑X小柱固相萃取，收集洗脱液，室温下氮吹至干，复溶于甲醇水溶液，引入LC‑MS/MS系统分析，可准确检测出加合物Propano‑dG的含量水平。本发明为全新的DNA中巴豆醛‑DNA加合物的测定方法，采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

主权项

一种巴豆醛‑DNA加合物的测定方法，所述巴豆醛‑DNA加合物是1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG），其特征在于：包括以下具体步骤：a、巴豆醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的巴豆醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液；将上述溶液放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；b、DNA的酶水解及纯化富集：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris‑HCl/5 mM MgCl2缓冲液中，向DNA溶液中加入20 μL内标溶液和60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经Strata‑X固相萃取，收集洗脱液液氮吹至干，复溶于100 μL 30%甲醇水溶液，即为样品待测液； c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的Propano‑dG标准工作溶液；d、液相色谱‑串联质谱（LC‑MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC‑MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量，在LC‑MS/MS测定中，选取Extend‑C18色谱柱，规格1.8 μm，4.6×100 mm，流动相体系选取0.01%甲酸甲醇A和10 mM乙酸铵水溶液B，梯度洗脱条件为：0‑2 min：32% A，2‑7 min：42% A，7‑10 min：32% A；流速为0.40 mL/min，分析时间为10 min，进样量为5 μL；串联质谱检测器具体条件如下：电喷雾离子源ESI，多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：600℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为45 psi，干燥气为50 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：150 ms；监测离子对为Propano‑dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[15N5]Propano‑dG为343.2→227.2。