[发明专利]一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法

摘要

本发明公开一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法。包括月季白粉病菌分离纯化和扩繁、月季白粉病菌孢子悬浮液制备、月季寄主材料准备、接种、病情观测和统计、分析及鉴定。在分离纯化和扩繁中将来自于月季野生种的白粉病菌转移到大花香水月季组培苗的叶片上，来自于月季栽培品种的白粉病菌转移到紫月季花组培苗的叶片上，选择了国内11份鉴别寄主材料，待鉴月季白粉病菌分离纯化和扩繁后接种在11份鉴别寄主材料，与月季白粉病菌生理小种类型对照表比对即可鉴定出生理小种类型。本发明供鉴别出11个月季白粉病菌生理小种类型，从接种到鉴定仅需要7天，并可对抗月季白粉病菌育种材料的选择提供指导。

主权项

1.一种月季白粉病菌生理小种的快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)月季白粉病菌的分离纯化和扩繁①在超净工作台上，用已灭菌的解剖针从采自于不同地点的感染了白粉病菌的月季叶片上，分别蘸取白粉病菌转移到组培瓶内的月季组培苗的叶片上，每蘸取一份白粉病菌材料，须更换新的解剖针，保证不同采集地点的白粉病菌不混合，且来自于月季野生种的白粉病菌转移到大花香水月季(Rosa odorata var.gigantea)组培苗的叶片上，来自于月季栽培品种的白粉病菌转移到紫月季花(Rosa chinensis var.semperflorens)组培苗的叶片上；一个采集地点的白粉病菌材料为一个样本，一个样本接种于一个组培瓶内的月季组培苗的叶片上，然后将接种了白粉病菌的组培瓶在组培室内，培养条件为：光照强度为1800～3200lx，光周期为10‑16h光期、8‑14h暗期，空气相对湿度75～90％，室温22～28℃的条件下培养5～9d；②用步骤(1)①同样的方法转移上述组培苗上的白粉病菌单菌落到相应的新的月季组培苗的叶片上，在步骤(1)①同样的培养条件下培养5～9d；③重复步骤(1)②3次；④重复步骤(1)②1次，培养时间改为15～20d；步骤(1)①至步骤(1)④培养期间，组培瓶内的培养基质均为MS+6‑BA 0.2mg/L+NAA 0.02mg/L+蔗糖35g/L+琼脂7.0g/L，且组培瓶瓶口用透气性塑料膜封盖；(2)月季白粉病菌孢子悬浮液的制备用已灭菌的毛刷将步骤(1)④中组培苗上的白粉病菌刷到含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，每刷一份白粉病菌材料，须更换新的毛刷，不同采集地点的白粉病菌刷入不同容器内的所述含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水中，保证不同采集地点的白粉病菌不混合；将每个容器内的孢子浓度用含有0.03％(v/v)吐温20的无菌蒸馏水调至1×10⁴～5×10⁴个/ml，用于接种备用；(3)月季寄主材料的准备采集如下鉴别寄主材料，采集从寄主材料月季枝条顶端向下第3～4层的完全展开的含有5片或7片叶的无病虫害的完全叶，先将采集的完全叶用解剖镜镜检，确保所采集的完全叶无任何真菌菌落或菌丝后，再用70％(v/v)乙醇处理1min,然后用无菌水清洗3～5次，用无菌的滤纸吸干完全叶表面的水分，叶面朝上平铺在盛有营养基质的培养皿中，每一种寄主材料的完全叶放置在一个培养皿内；所述营养基质配方：MS+苯并咪唑0.4g/L+琼脂8.0g/L；所述鉴别寄主材料为：木香花(Rosa banksiae)、悬钩子蔷薇(Rosa rubus)、复伞房蔷薇(Rosa brunonii)、弯刺蔷薇(Rosa beggeriana)、‘绿萼’(Rosa‘Vidiflora’)、‘匍匐红’(Rosa‘Pufuhong’)、‘思春’(Rosa‘Sichun’)‘蜜糖’(Rosa‘Mitang’)、‘粉嘟嘟’(Rosa‘Fendudu’)、‘云玫’(Rosa‘Yunmei’)、‘粉妆阁’(Rosa‘Fenzhuangge’)；(4)月季白粉病菌的接种采用喷雾法或滴液法将步骤(2)来自于不同采集地点的白粉病菌孢子悬浮液分别接种到步骤(3)所述培养皿内的每片叶片上，保证肉眼可见每片叶正面被白粉病菌孢子悬浮液覆盖，每个样本设置3～5个重复；接种完成后，将培养皿在室内光强1800‑3200lx、光周期为10‑16h光期、8‑14h暗期，空气相对湿度85～95％、室温22‑28℃的条件下培养7d；(5)月季寄主材料的病情观测和统计接种叶片病情划分为2个等级：0级：抗病，叶片无病斑或<1/5叶面积发病；1级：感病，≧1/5叶面积发病；(6)分析及鉴定生理小种将步骤(5)的统计结果0级用0表示，1级用1表示，一一对应地将不同寄主材料与不同采集地点来源的白粉病菌之间的抗/感性结果列表，并与如下表1月季白粉病菌生理小种类型对照表进行比对鉴定出月季白粉病菌生理小种的类型；表1 月季白粉病菌生理小种类型对照表