[发明专利]一种含OmpU抗体的免疫磁珠及其制备与捕获-多重PCR检测病原弧菌的方法

摘要

本发明涉及一种含OmpU抗体的免疫磁珠及其制备与捕获‑多重PCR检测病原弧菌的方法，用弧菌的基因组作为模板PCR扩增OmpU基因，获得较纯的OmpU重组蛋白作为抗原制备抗体，经过偶联‑洗涤的过程制备出含OmpU抗体的免疫磁珠；免疫磁珠能够捕获多种弧菌，然后用基于danJ基因设计的多重PCR特异性引物进行鉴定。最多同时检测副溶血弧菌、霍乱弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌，可广泛应用于环境及进出口食品检验中。本发明结合了免疫分离的特异性和PCR扩增的高效性，具有分离、浓缩、富集的能力，能够对样品中低浓度的病原菌进行高效的分离和富集，降低或消除了样品对PCR的抑制、影响，提高检测的极限，具有很好的应用前景。

主权项

一种含OmpU抗体的免疫磁珠的制备，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)以一种或者多种弧菌的基因组作为模板进行PCR扩增OmpU基因；(2)将步骤(1)所得PCR产物连接到pET‑32a构建异源表达载体，转化到大肠杆菌；(3)将步骤(2)所得OmpU重组菌接种到LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长期，加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h；(4)离心收集步骤(3)所得菌体，利用亲和层析进行纯化，获得纯的OmpU重组蛋白；(5)将步骤(4)所得纯的OmpU重组蛋白作为抗原制备OmpU重组蛋白抗体；(6)将磁珠混匀后加入离心管中，再加入洗涤缓冲液PBST混匀，置于装有强力磁铁的磁架静置，弃液体；重复操作多次后加入重悬液重悬磁珠；(7)往步骤(6)的磁珠中加入步骤(5)所得OmpU重组蛋白抗体；4℃轻缓旋转振荡孵育18～24h，制备成一种或者多种弧菌OmpU抗体的免疫磁珠；(8)用洗涤缓冲液PBST清洗和重悬缓冲液重悬，4℃保存。