[发明专利]绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO-meAg5及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5及其制备方法和应用，通过MO基因组的提取、表达文库的构建、筛选，MO多表位融合抗原基因的构建和在大肠杆菌中的表达，得到具有良好免疫原性的抗原蛋白，即本发明的绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5，为进一步研制开发安全、高效的绵羊支原体肺炎多表位蛋白疫苗奠定基础。

主权项

1.一种绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5的制备方法，其特征在于，主要包含以下过程：MO基因组的提取；MO基因组表达文库的构建；MO抗原基因的免疫学筛选；MO多表位融合抗原基因的构建方法；MO多表位融合抗原基因在大肠杆菌中的表达；其具体过程如下： MO基因组的提取：将纯化后的菌株转接于培养基中，于36～38℃、浓度为4～6%的CO2培养箱中培养5～9天，当生长滴度达到109CCU/ml及以上时，10000～16000r/min离心10～20min，收集菌体，弃上清，然后采用Mycoplasma gDNA Mini Kit提取试剂盒提取得到绵羊肺炎支原体的总DNA；MO基因组表达文库的构建：用Sau3A I酶对MO总DNA进行酶切，使酶切的基因组片段集中于0.5～3kb，然后按照酶切体系Sau3A I酶于36～38℃，酶切0.5～1.5μg基因组DNA 2～2.5h进行酶切；将酶切的片段通过T4DNA连接酶连接于经BamH I酶切并去磷酸化处理的pET28 表达载体中，然后将连接产物转化于DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素的LB平板上，于36～38℃培养12～14h；按照分子克隆技术提取质粒，再将其转入BL21大肠杆菌感受态细胞中，同样涂布于含有卡那霉素的LB平板上，于36～38℃培养12 ～14h；得到含有绵羊肺炎支原体基因片段的大肠杆菌，即绵羊肺炎支原体基因组表达文库；MO抗原基因的免疫学筛选：将所构建的绵羊肺炎支原体基因组表达文库等份稀释，涂于含有卡那霉素的LB平板上36～38℃培养7～8ｈ；将克隆菌复制于硝酸纤维素膜上置于一个新的含卡那霉素LB平板上培养2～3h后，再将此含菌的NC膜置于含有1～1.2mM的IPTG的LB琼脂板，36～38℃培养4～6h，然后将有细菌菌落的NC膜在氯仿蒸汽中曝光裂解15～25min，于空气中干燥；将NC膜放入裂解液中于室温缓慢摇动14～16h；然后将NC膜放入TBST缓冲液中漂洗3～5次，每次20～30min；将NC膜再放入封闭缓冲液中室温缓慢晃动1～1.5h，再用TBST缓冲液漂洗2～4次，每次10～20min；再将NC膜放入用封闭缓冲液按1：2500～1:3500稀释被处理过的阳性血清中，室温孵育1～1.5h，分别用含0.05～0.15%BSA的TBST缓冲液、含有0.05～0.15%BSA和0.05～0.15%Tween‑20的TBST缓冲液、含0.05～0.15%BSA的TBST缓冲液各洗涤3～5min；最后将NC膜放入用封闭缓冲液按1:4500～1:5500稀释的HRP标记的兔抗绵羊IgG溶液中，室温孵育1～1.5h后，用TBST缓冲液洗涤3～5次，每次30～40min；用TMB显色液覆盖于NC膜上，挑取NC膜上颜色较深的阳性斑点反复进行筛选验证；挑选出阳性克隆菌在含10μg/ml～50μg/ml的卡那霉素的LB液体中培养，当其OD600nm达到0.6～0.8时，加入终浓度为1～1.2mM的IPTG进行诱导，在36～38℃剧烈摇动培养6～8h，得到表达的绵羊肺炎支原体相关蛋白；MO多表位融合抗原基因的构建：通过编码柔性氨基酸的核苷酸GGCCCGGGC将具有编码线性优势抗原表位的单个基因串联在一起，构建一个具有多表位融合抗原基因的串联体，其氨基酸序列如序列表中序列1所示；对融合基因中的大肠杆菌稀有密码子进行预测分析，并用编码相同氨基酸的核苷酸的大肠杆菌偏爱密码子替换稀有密码子，通过基因体外合成的方式合成MO多表位融合基因，其氨基酸序列如序列表中序列2所示；MO多表位融合抗原MO‑meAg5基因在大肠杆菌中的表达：通过常规分子克隆技术构建pMD19‑T‑ MO‑meAg5重组质粒，采用EcoR I和XholI分别对pMD19‑T‑ MO‑meAg5质粒和pET32a（+）质粒进行双酶切，采用T4 DNA连接酶构建一个pET32a（+）‑ MO‑meAg5重组质粒，将该质粒转入DH5α感受态细胞中，涂布于含有Amp的固体LB平板上，36～38℃培养11～14h，挑取单个菌落进行菌液PCR验证，将阳性菌落测序，同时提取阳性菌落质粒进行双酶切验证，得到pET32a（+）‑ MO‑meAg5重组质粒；将鉴定正确的pET32a(+)‑MO‑meAg5重组表达质粒转化至表达工程菌BL21 E.coli中，36～38℃培养12～14h，挑选菌落并用PCR进行筛选，将筛选到的阳性菌转接到含有Amp的液体LB培养基中，36～38 ℃培养至OD600nm为0.6～0.8，加入终浓度为0.5～1.5 mmol/L的IPTG进行诱导，诱导6～10 h后收集菌液；得到绵羊肺炎支原体多表位融合抗原MO‑meAg5。